本试剂盒是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶 (LDH) 活性进而测定细胞毒性、细胞增殖和细胞损伤的试剂盒。 LDH是存在于血清和细胞质的一种酶，当细胞膜受到损伤时，LDH会释放到培养基中。由于释放出的LDH稳定，检测培养基中LDH量可以作为测定死细胞和受损细胞数量的指标。

  本试剂盒可以测定受损细胞所释放出的LDH，其原理是LDH催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体可将水溶性四唑盐WST (无色) 还原成甲臜产物 (橙色)，WST甲臜产物的吸光度与LDH量呈正比，利用此原理可以测定死细胞和受损细胞的数量。

  本试剂盒中试剂不会和活细胞反应，而且对细胞无损害，可以直接添加到含有细胞的培养基中检测 (一步法)。也可以分离细胞后，加到培养基中检测 (低损伤法，分离的细胞可以做其他实验)。

  本试剂盒采用稳定性高的WST，配置后的溶液可以长时间保存，不需要现配现用，适用于高通量筛选。

                         图 1. 反应原理图

特点：

v 双重选择：有2种检测方法 (一步法、低损伤法)

v 操作简单：不需要分离死细胞和活细胞，就可检测死细胞的LDH

v 仪器常用：采用常规酶标仪检测

v 稳定方便：工作液可冷藏保存6个月，不需要现配现用

v 双重验证：配合使用CCK-8可获得死细胞和活细胞的结果

 1. 用培养基洗涤细胞后，制成5×10⁵ cells/mL的细胞悬液；

    （细胞数量可做预试验进行梯度稀释来确定）； 

 2. 吸取50μl的细胞悬液至平底96孔板中； 

    如为贴壁细胞，可接种至96孔板过夜预培养，换新50μl培养基后，进行下步；

 3. 按表1加入50 μl含有药物的培养基，及各对照组，每组设三个孔； 

                             表1 各孔的溶液量    

 4. 37℃ CO₂培养箱内培养预定药物作用的时间（最好小于24小时）； 

 5. 在高对照孔中加入10μl 裂解液，37℃ CO₂培养箱，培养30 min；

 6. 配制工作液：将底物用10mL反应Buffer溶解，再加入1mL显色液，充分混合，即配成工作液；

 7. 每孔加入100μl工作液，避光、37℃孵育5-30min（可预试验优化时间）；

 8. 每孔加入50μl终止液，酶标仪测定490nm吸光度。

9. 计算细胞毒性（损伤率）

    计算「样品孔-样品Blank孔」、「高对照孔-高对照Blank孔」、「低对照孔-背景Blank孔」的吸光度后，算出n=3的平均值。

    细胞毒性（损伤率）根据如下公式计算：

    细胞毒性（损伤率）(%) = [(A-C)/(B-C)] ×100

        A：样品的吸光度 (样品孔-样品Blank孔)

        B：高对照的吸光度 (高对照孔-高对照Blank孔)

        C：低对照的吸光度 (低对照孔-背景Blank孔)

   4℃，1年