G6P含量检测试剂盒(WST-8法) 是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6P含量的检测试剂盒。 Ø

    G6P (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又称6-磷酸葡萄糖)是葡萄糖的第6位碳上的羟基在己糖激酶催化下发生磷酸化后生成的分子，是细胞中常见的糖代谢小分子，参与糖酵解(glycolytic pathway)和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway)、糖异生等生化途径。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH的主要途径。在糖异生过程中，葡萄糖-6-磷酸经葡萄糖-6-磷酸酶催化，发生磷酸酯水解反应，生成葡萄糖。是糖异生途径中的关键步骤之一。除了这三个代谢途径外，当血糖高时，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被存储起来。

  本试剂盒检测原理如下：葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，在这一反应过程中NADP+ 被还原为NADP，生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的G6P的量呈正比关系。 WST-8法检测G6P的原理参考图1。

                        图1. WST-8法检测G6P的原理图 

    本试剂盒适用于检测细胞、组织、血液以及其它适当样品。 

    本试剂盒用于96孔板，按每孔体积100μl 可以测定100个样品。

特点：

   本试剂盒WST-8法与WST-1、MTT、XTT等相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。线性范围更宽，灵敏度更高，使用便捷。

   本试剂盒使用细胞、组织等的裂解液、体液即可进行检测，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的G6P。 

   本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。可以检测含量低至1nmol的G6P，在1nmol至30nmol之间呈现良好的线性关系。

A：G6P标准溶液的制备

  组份C 提取液解冻后置于冰上预冷备用。

  把组份D的G6P标准品（10mM）用组份C 提取液稀释成1mM标准液,在 96孔板每孔加入0, 2, 4, 6, 8, 10 μL 的1mM标准液, 并用G6P提取液每孔补至50μL体积, 则成为 0 (空白), 2, 4, 6, 8和10 nmole/孔的标准溶液。 

B：样品的准备     

  细胞和组织样品： 取约1-5×10⁶个细胞或约10–100 mg剪碎的组织样品用PBS洗涤后，加入200μl或2-3个体积预冷的提取液（组份C），置冰上吹打或匀浆，以促进裂解释放G6P。随后12,000g，4ºC 或超滤离心，取上清作为待测样品，置冰上备用。       

  液体样品： 可直接进行检测或超滤离心以去除干扰的酶，取上清作为待测样品，置冰上备用。

C: 分析反应

   1. 配制G6P分析液：

      根据所需检测的背景对照、标准品和样品的数量，按下表配制适量的G6P分析液，并注意现配现用。

 2. 样本测定

•  取一定体积Sv≤50μL（可以预优化）的待测样本加至96孔板的孔中，不足50μL则用提取液补至50μL； 
•   吸取上述分析液，按每孔50μL的加至样本和标准溶液各孔中，每孔共100μL，置摇床或用移液器混匀；  
•  室温，避光，反应30 min；

    3. 酶标仪测 450 nm (A450)

D：样品中G6P含量的计算

  1. 将0 nmol标准溶液作为背景对照。将全部（标准品和样品）的吸光度减去背景对照的吸光度  

  2. 以标准溶液G6P浓度为横坐标，减去背景值的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。

    依据标准曲线 从样品的吸光度 确定样本的nmol数（Sa）。

    则样本G6P的含量(浓度）C = Sa/Sv   

    （Sa：样本的nmol数，Sv：加入孔里的样本体积， 见C2步）

     G6P分子量: 260.14 g/mole

   例：某样本

    Sa = 5.84 nmole    Sv = 50 μL

    其G6P 含量(浓度）C = 5.84 nmole/50 μL = 0.1169 nmole/mL

              0.1169 nmole/mL × 260.14 ng/nmole= 30.41 ng/mL

-20℃，1年