葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH检测试剂盒(WST-8法) 是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6PDH活性的检测试剂盒。 Ø

   葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，简称G6PDH或G6PD)可催化葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G6P)转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂(6-phosphogluconate, 6-PG)，这是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的第一步，也是该途径的限速步骤。磷酸戊糖途径对于NADPH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也称为还原型辅酶II)和戊糖的生成至关重要。NADPH对于通过GSH的再生来调控氧化还原平衡以及脂肪酸生物合成来说都至关重要。所以G6PDH的缺乏会导致由于不能生成NADPH而引起的一些疾病，如新生儿黄疸、非免疫性溶血性贫血等。

  检测原理：葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，在这一反应过程中NADP+ 被还原为NADP，生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中G6PDH活性呈正比关系。 WST-8法检测G6PDH的原理参考图1。

           图1. WST-8法检测G6PDH的原理图 

    本试剂盒适用于检测细胞、组织、血液以及其它适当样品。 

    本试剂盒用于96孔板 按每孔体积100μl 可以测定100个样品。

特点：

• 本试剂盒WST-8法与WST-1、MTT、XTT等相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。线性范围更宽，灵敏度更高，使用便捷。
• 本试剂盒使用便捷  使用细胞、组织等的裂解液、体液即可进行检测，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的G6PDH。
• 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。可以每孔含量低至0.05mU的G6PDH，在1mU/ml (0.05mU/孔)至100mU/ml (5mU/孔) 之间呈现良好的线性关系。

 A：G6PDH标准溶液的制备

  组份D 提取液解冻后置于冰上预冷备用。

  将G6PDH标准品（组份E  250mU/μL）用提取液(组份D)稀释100倍为2.5mU/μL的标准液,  在96孔板每孔加入0, 0.5, 1, 2，5, 10μL的标准液, 并用提取液每孔补至50μL体积, 则成为 0 (空白), 1.25, 2.5, 5,12.5, 25mU/孔的标准溶液。 

B：样品的准备     

  细胞和组织样品： 取1×10⁶个细胞或10–100 mg红细胞或10–20 mg剪碎的组织样品用PBS洗涤后，加入200–400μl或等体积的预冷提取液（组份D），置冰上吹打或匀浆，以促进裂解释放G6PDH。随后12,000-15,000g，4ºC 离心10分钟，取上清1-50μL作为待测样品，置冰上备用。       

C: 分析反应

   1. 配制G6PDH分析液：

      根据所需检测的背景对照、标准品和样品的数量，按下表配制适量的G6PDH分析液，并注意现配现用。

 2. 样本测定

•  取一定体积Sv≤50μL（可以预优化）的待测样本加至96孔板的孔中，不足50μL则用提取液补至50μL； 
• 吸取上述G6PDH分析液，按每孔50μL加至样本和标准溶液各孔中，每孔共100μL，置摇床或用移液器混匀；  
• 37ºC，避光，反应5-10 min（如果显色淡 可以延长15-30min）；

    3. 酶标仪测 450 nm (A450)

D：样品中G6PDH活性的计算

  1. 将0 mU标准溶液作为背景对照。将全部（标准品和样品）的吸光度减去背景对照的吸光度  

  2. 以标准溶液G6PDH浓度为横坐标，减去背景值的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。

    依据标准曲线 从样品的吸光度 确定样本的活力单位数（Su）。

    则样本G6PDH的活性为 Su/Sv   

    （Su：样本的活力单位数mU，Sv：加入孔里的样本体积， 见C2步）

   例：某样本

    Su = 5.84 mU 

    Sv = 50 μL

    其G6PDH的活性 = 5.84mU /50μL= 116.8 U/L 

    -20℃，1年