NADP+/NADPH检测试剂盒(WST-8法) (NADP+/NADPH Assay Kit with WST-8)是一种基于循环反应酶法结合WST-8的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NADP+ (氧化型辅酶II)和NADPH (还原型辅酶II)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。

   NADP (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是很多氧化还原反应的辅酶，包括NADP+ (氧化型)和NADPH (还原型)两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。在动物细胞中，戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPP)的氧化阶段是NADPH最主要的来源。监测NADPH的浓度水平一直受到关注。NADP+/NADPH的定量测定在细胞或组织的能量转换和氧化还原状态的研究中具有应用。也常用于药物体外代谢的研究。

原理Ø     

   NADP+/NADPH的传统检测方法是速率法，即检测NADPH在340nm处吸收波长的变化，该方法灵敏度较低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰，并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补NADPH在340nm处吸光度过小的不足，因此该传统检测方法具有很大的局限性。 Ø

   本试剂盒基于循环反应酶法检测样品中的 NADP+/NADPH以及它们的比值，具体原理如下：

a. 测 定NADP+/NADPH的 总量：

葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)在G6P脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，在这一反应过程中NADP+被还原为NADPH；生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将 WST-8还原生成橙黄色的formazan，在450nm左右检测有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的 NADP+/NADPH的总量呈比例关系。WST-8法检测NADP+ 和NADPH总量的原理参考图1。

b. 单独测定NADPH的量：

样品60ºC水浴加热30分钟后，样品中NADP+会分解而只保留NADPH。NADPH将WST-8还原成 formazan，通过比色法确定反应生成的formazan的量，最终可以确定样品中NADPH的量。

c. 测定NADP+以及NADP+/NADPH比值：

根据前两步检测获得的NADP+和NADPH总量以及NADPH的量，即可得到样品中NADP+的量以及NADP+/NADPH的比值。

                图1. WST-8法检测NADP+和NADPH的原理图

本方法的特点： 

  WST-8和WST-1、MTT或其它如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比其它产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比其它更加稳定，使实验结果更加稳定。再有，WST-8检测的线性范围更宽，灵敏度更高。 Ø

  本试剂盒使用便捷，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NADP+和NADPH，且特异性检测NADP+和NADPH，而不检测NAD+和NADH。

本试剂盒可以检测含量低至0.05μM (2.5pmol)的NADP+或NADPH，在0.05μM (2.5pmol)至6μM (300pmol) 之间呈现良好的线性关系。

  本试剂盒适用于检测细胞、组织以及其它样品中的NADP+和NADPH各自的量、比值和总量。  

  当仅检测样品中NADP+和NADPH的总量或NADPH的量时，一个本试剂盒可以进行100次检测；当检测NADP+或者NADP+/NADPH 的比值时，一个本试剂盒可以进行50次检测。

 1. NADPH标准曲线制备

  将NADPH标准品（1mM的混悬液，混匀后取用)用提取液稀释100倍至10μM的标准液，在96孔板中每孔加0、2、4、6、8、10μL的标准液，并用提取液补足至50μL体积，则各孔标准品的浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2μM，相当于每孔0、20、40、60、80、100pmols/孔。其中将0μM孔为空白对照。注意：由于NADPH很不稳定，故配制后需尽快使用。

2、样品的准备：

 a. 细胞样品：  约5-40×10⁵个细胞去除培养液，加入 300μL的提取液，置冰上轻轻吹打，以促进细胞裂解释放内容物；随后12,000g，4ºC或置10KD超滤管（自备）离心10分钟，取上清作为待测样品备用（每个样品至少需200μL)。

b. 组织样品：称取约10-30mg的组织样品预冷的PBS洗涤，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μL 的提取液在冰上进行匀浆。随后12,000g，4ºC或置10KD超滤管（自备）离心10分钟，取上清作为待测样品备用（每个样品至少需200μL)。

c.血浆、尿液等液体样品可直接使用。

d.取部份样品至少100μL于60ºC水浴加热30分钟， 如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4ºC离心5分钟，取上清至少100μL用于NADPH的测定。

3.分析工作液的配制：

    取200uL 的G6PDH加入5mL 的分析Buffer，再加入0.5mL显色液，即配成分析工作液，每孔50μL可供1个96孔板，即配即用。

4. 样品测定：

a. 样品中NADP+和NADPH的总量和NADPH的测定：

  吸取50μl待测样品及60ºC水浴加热后的样品至96孔板中，设复孔。

b. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，设复孔。先加入样品和标准、品，最后用多通道移液器同时在各孔加入50μL分析工作液。

d. 37ºC，避光，孵育5-10分钟，形成橙黄色的formazan。

e. 测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至20-30分钟。

 5. 样品中NADP+/NADPH量的计算：

a. 计算标准品组中各孔的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各标准品的吸光度。

  用标准品浓度与对应的吸光度作标准曲线。

b、根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NADP+和NADPH总浓度[NADP（H）total] 或者NADPH的浓度[NADPH]。

未经60ºC加热处理时，检测得到的是样品中NADP+和NADPH总量的浓度(NADP（H）total)；60ºC加热处理后，检测得到的是样品中NADPH的浓度[NADPH]。

根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NADP+、NADPH、NADP（H）total的量。

c、根据如下计算公式，计算样品中NADP+的量以及NADP+ /NADPH的比值。

此时可以把NADP+ 和NADPH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。

[NADP+] = [NADP（H） total] - [NADPH]

[NADP+]/[NADPH] = ([NADP（H）total] - [NADPH])/[NADPH]

d. 如果希望更加精确地来表述NADP+和NADPH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NADP+和NADPH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。

-20ºC，一年