总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒(WST-8法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-8)是一种通过酶偶联反应结合WST-8的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD活性的试剂盒。 

   超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢(H₂O₂)和氧(O₂)，是生物体内一种重要的抗氧化酶。

   传统检测SOD活性使用NBT(氮蓝四唑)法和细胞色素C法。但前者产生甲臜染料水溶性差，易和被还原的黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase XOD）相互作用，抑制百分率达不到100%等，从而使检测的灵敏度和精确度受到影响。后者细胞色素C氧化活性高，易受样品中的还原剂干扰，要连续测定吸光度值，检测灵敏度比较低，并不适合大批量样本的检测。

   本试剂盒采用了目前最先进的WST-8法，检测原理（图1）为：WST-8与经黄嘌呤氧化酶XOD催化产生的超氧化物阴离子(O₂^.- )反应产生水溶性的红色甲臜(formazan)，该反应步骤可被SOD所抑制，甲臜的减少量（抑制率）与酶量（酶活）的对数成正比，因此通过对甲臜的比色即可计算SOD的酶活力。

              图1. 基于黄嘌呤氧化酶XO偶联反应体系和WST-8的SOD酶活力检测原理图。

产品特点

   WST-8的反应产物是稳定的水溶性产物，可以通过单个时间点的吸光度检测来测定SOD活力，适合高通量筛选研究。

   WST-8法测定最大抑制百分率可以接近100%，并不受一些常见干扰因素，如内源过氧化氢的干扰，使检测效果比其它方法显著改善。 

   WST-8法的性能优于NBT法和细胞色素C法，灵敏度更高，线性范围更宽，更加稳定，可以检测出低达0.5U/ml的SOD。

   本试剂盒可用于检测细胞或组织匀浆液上清、全血、红细胞抽提物、血清等生物样品中的SOD活性。一个试剂盒共可以进行100次检测。 

1、样品制备：

  注： 因SOD检测易受去污剂等干扰（附1)，因此尽量不用或少用此类干扰试剂。

a. 红细胞、血浆或血清样本

（1） 取2-3ml抗凝血，4℃，600×g离心10min，弃上清血浆（或备作他用）；

（2） 在沉淀中加入等体积的4℃预冷的dH₂O，制成红细胞悬液； 

（3） 取0.1mL 红细胞悬液加入0.9mL预冷dH₂O，再加入0.5mL 乙醇和0.3mL氯仿； 

（4）涡旋剧烈振摇1min，4℃，10000×g离心60min，将上清移入一支新离心管中。

（5）上清用dH₂O稀释100倍，作为红细胞待测样品。

  * 血浆和血清样本也同样用乙醇和氯仿 、离心取上清作为待测样品。

  * 如果样本需要进一步稀释时，需在稀释液dH₂O中加入终浓度为0.25%的乙醇。

b.组织 (100 mg)

（1）冷生理盐水清洗组织，尽量去除血液。用纸巾吸干水分后称重并记录。

（2）样品加入0.5-1ml的冷PBS,

（3）用匀浆器匀浆，必要时置冰浴超声破碎(60 W，0.5s间隔，15 min)。

（4）4℃，10000×g离心60 min，将上清液移入新离心管中，作为待测样品。

c.细胞 （10⁶-10⁷）

（1）细胞加1ml的冷PBS，4℃，2000×g 离心10min，弃上清。重复洗一次。

（2）细胞沉淀用匀浆器匀浆, 将细胞破碎。

（3）加入1ml新的冷PBS，必要时置冰浴超声破碎(60W，0.5s间隔，15 min)。

（4）4℃,10000×g离心15 min，将上清液移入新离心管中，作为待测样品。

d. BCA法测定样品的蛋白浓度

  通常10-20µg蛋白的SOD活力约1个活力单位(仅作为参考，不同细胞和组织的差异较大，参考附2)。每份样品准备20-100µg蛋白通常足够用于后续检测。

如果希望建立标准曲线， 则需自备SOD的标准品，用酶稀释液按照如下梯度稀释SOD标准品， 200 U/ml, 100 U/ml, 50 U/ml, 20 U/ml,10 U/ml, 5 U/ml, 1 U/ml, 0.1 U/ml,0.05 U/ml, 0.01 U/ml, 0.001 U/ml，并按样本检测的相同方法进行操作。

2. 配制WST-8反应液 （即用即配）

  1mL的WST-8 加入15mL的分析Buffer配制成WST-8反应液，在96孔板每孔加160µl WST-8反应液，避光4ºC暂存；

3. 配制酶工作液（即用即配）：

100µl酶液加入1.9ml酶稀释液配制成酶工作液，冰浴暂存，应当天使用，不得保存。

注：由于酶液量较少且易沉降或分层，使用前先轻轻离心3秒，轻吸打混匀后再使用。

4. 配制反应液、启动反应

    参考下表分组、设复孔，按次序加入各反应组份，最后用多通道移液器将酶工作液同时加入样品孔和空白1组，以启动反应并减少反应时间误差。

5. 37℃避光孵育20 min；  

6. 酶标仪450 nm测OD值（A）；

7. 计算SOD抑制率（对WST-8的抑制率）

SOD抑制率% = [(A_空白1 - A_空白3) - (A_样品 - A_空白2)] / (A_空白1 - A_空白3)×100

8.  SOD活力和比活性的检测和计算:

• SOD的活力

  SOD活力单位(unit)的定义:  本体系20µl样品中能够抑制50%的WST-8与超氧阴离子还原反应所需的酶量为一个酶活力单位(unit)。 

检测SOD活力的方法

将样本用酶稀释液稀释7个浓度梯度，按上述检测SOD抑制率的方法检测；

建议预试样本的稀释倍数，以确定SOD抑制率在约50%为中心的样本稀释梯度；

如果样品的抑制率没有达到50%以上，请增加样本量或者提高样品溶液的浓度。

 SOD活力的计算

先计算出样本各浓度梯度的SOD抑制率，按上述SOD活力定义，则样本SOD活力为SOD抑制率为50%时酶量（IU)乘以其稀释倍数，即为酶活力U。

因不同测定方法SOD酶活力绝对值相差很大，可用SOD标准品建立标准曲线方法确定准确的活力值。

• SOD的比活性： 

   SOD的活力U与蛋白量（BCA法）之比，即U/mg，

   例：10ug蛋白检测出SOD的抑制率为50%（即1U），则SOD的比活性为：100U/mg。

附1：SOD检测中常见干扰物质的干扰浓度

附2：部分样本的总SOD活力

附3：血细胞SOD的抑制曲线图

-20℃，1年