NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法) (NAD+/NADH Assay Kit with WST-8)是一种基于循环反应酶法结合WST-8的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NAD+ (氧化型辅酶I)和NADH (还原型辅酶I)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。

   NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括NAD+(氧化型)和 NADH (还原型)两种形式。NAD+既是氧化还原反应过程中传递电子的辅酶，又可以作为很多酶的底物来参与细胞内反应，例如在ADP(二磷酸腺苷)-核糖基化反应和作为去乙酰化酶的底物中发挥着关键作用，包括Sirtuins家族的Sirt1等去乙酰化酶就需要以NAD+作为底物进行去乙酰化反应来调控蛋白的乙酰化水平从而参与细胞的生命活动过程。NAD+在细胞和体内发挥着重要的功能，其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等，并且NAD+的减少是细胞死亡的主要因素之一。虽然NMNAT (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase)是 NAD+的合成酶，包括Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，但NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)通常被认为是NAD+合成的限速酶。NAD+在调节细胞氧化还原状态方面的重要性以及调控信号通路及转录方面的功能，使得NAD+及其合成和消耗的酶成为多种疾病的潜在药物靶点。

      NAD+ /NADH的传统检测方法是速率法，即检测NADH在340nm处吸收波长的变化，该方法灵敏度较低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰，并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补NADH在340nm处吸光度过小的不足，因此该传统检测方法具有很大的局限性。 Ø

   本试剂盒基于循环反应酶法检测样品中的NAD+、NADH以及它们的比值，具体原理如下：

a. 测定NAD+和NADH的总量：

 乙醇(Ethanol)在乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)的作用下氧化生成乙醛 (Acetaldehyde)，在这一反应过程中NAD+被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5- methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中NAD+和NADH的总量呈比例关系（参考图1）。

b. 单独测定NADH的量

60ºC水浴加热30分钟后，样品中NAD+会分解而只保留NADH。NADH将WST-8还原成formazan，通过比色法确定反应生成的formazan的量，最终可以确定样品中NADH的量。

c. 测定NAD+以及NAD+/NADH比值

 根据前两步检测获得的NAD+和NADH的总量以及NADH的量，即可计算得到样品中 NAD+ 的量以及NAD+/NADH的比值。

                图1. WST-8法检测NAD+和NADH总量的原理图

本方法的特点： 

   WST-8和WST-1、MTT或其它如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比其它产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比其它更加稳定，使实验结果更加稳定。再有，WST-8检测的线性范围更宽，灵敏度更高。 Ø

  本试剂盒使用便捷，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NAD+ 和NADH，并且能特异性检测NAD+和NADH，而不检测NADP+和NADPH。

  本试剂盒可以检测含量低至5pmol的NAD+或NADH，在0.5pmol至200pmol之间呈现良好的线性关系。

  本试剂盒适用于检测细胞、组织以及其它样品中的NAD+和NADH各自的量、比值和总量。 Ø在检测组织及其它样品中的NAD+、NADH及其比值时，考虑到有些样品本身的颜色对450nm处吸光值的检测有影响，建议设置加入样品而不加入乙醇脱氢酶的对照。 Ø

  当仅检测样品中NAD+和NADH的总量或NADH的量时，一个本试剂盒可以进行100次检测；当检测NAD+或者NAD+/NADH 的比值时，一个本试剂盒可以进行50次检测。

 1. NADH标准曲线制备

将1mM的NADH标准品原液用超纯水稀释100倍成为10μM的标准液，在96孔板中每孔加0、2、4、6、8、10μL，每孔用超纯水补足体积至50μl，每孔则为 0、20、40、60、80、100pmol/孔，其中将0μL孔为空白对照。注意：由于NADH很不稳定，故配制后需尽快使用。

2、样品的准备：

 a. 细胞样品：约2.5×10⁵-1×10⁶个细胞去除培养液，加入220μl的提取液，置冰上轻轻吹打，以促进细胞裂解释放内容物；随后12,000g，4ºC或置10KD超滤管（自备）离心10分钟，取上清作为待测样品备用（每个样品至少需100μl)。

b. 组织样品：称取约10-30mg的组织样品预冷的PBS洗涤，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μl的提取液在冰上进行匀浆。随后12,000g，4ºC或置10KD超滤管（自备）离心10分钟，取上清作为待测样品备用（每个样品至少需200μl)。

c.血浆、尿液等液体样品可直接使用。

d. 取至少100μl的样品于60ºC水浴加热30分钟，NAD+会分解而只保留NADH，用于检测和确定样品中NADH的量。如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4ºC离心5分钟，吸取上清液用于后续测定。

3.  分析工作液的配制：

   在5mL分析Buffer中加入0.4mL的乙醇脱氢酶和0.5mL的显色液，即配成5.9mL分析工作液，可供1个96孔板，现配现用。

4. 样品测定：

a. 样品中NAD+和NADH总量、NADH的测定：

  吸取50μl未加热的样品和60ºC加热后的样品至96孔板中，设复孔。

b. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，设复孔。先加入样品和标准品，最后用多通道移液器同时在各孔加入50μl分析工作液。

c. 37ºC，避光，孵育10分钟，形成橙黄色的formazan。

d. 测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至20-30分钟。

 5. 计算：

      a、标准品组中各孔的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。

      b、以NADH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。 

c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NAD+和NADH总浓度[NAD（H）total] 或者NADH的浓度[NADH]。未经60ºC加热处理时，检测得到的是样品中NAD+和NADH总量的浓度(NAD（H）total)；60ºC加热处理后，检测得到的是样品中NADH的浓度[NADH] 。

    备注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NAD+、NADH、NAD（H）total的量。

d. 根据如下计算公式，计算样品中NAD+的量以及NAD+ /NADH的比值。此时可以把NAD+ 和NADH总量或各自的含量用单 位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。

[NAD+] = [NAD（H） total] - [NADH]

[NAD+]/[NADH] = ([NAD（H）total] - [NADH])/[NADH]

e. 如果希望更加精确地来表述NAD+和NADH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NAD+和NADH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。

-20ºC，一年