线粒体超氧化物是氧化磷酸化的副产物。在另一个密切关联的电子传输链中，大约1-3%线粒体消耗的氧未被完全还原；这些“漏”掉的电子能迅速与氧分子相互作用生成超氧阴离子，成为线粒体中主要的活性氧（ROS）。胞内超氧化物的增加与心血管疾病相关，包括高血压、动脉粥样硬化和糖尿病相关的血管损伤，还包括神经退行性疾病，如帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。线粒体是ROS的主要细胞内来源的假设主要基于对分离线粒体的实验，而不是对活细胞直接测量。

线粒体超氧化物荧光探针MitoSOX Red是一种新型荧光染料，分子量759，用于高选择性检测活细胞线粒体中的超氧化物（图1）。MitoSOX Red可透过活细胞膜，快速、选择性地靶向结合线粒体。一旦进入线粒体，MitoSOX Red就会被超氧化物氧化并呈现红色荧光，并且仅易被超氧化物氧化，但不易被其他活性氧（ROS）或活性氮（RNS）所氧化，超氧化物歧化酶SOD可保护荧光探针不被氧化。氧化产物在与核酸结合时可发出强烈荧光。本品可以区分出从活细胞分离出的线粒体和直接检测活细胞线粒体产生的超氧化物。本品为氧化应激相关疾病治疗药物的发现提供一个有价值的工具。

图1. ＭitoSOX Red的选择性

使用无细胞体系制备各种活性氧（ROS）和活性氮（RNS）；然后10μM的ＭitoSOX Red溶液中分别加入各种氧化剂，37℃孵育10分钟。加入过量的DNA（除非另有说明），并于37℃再孵育15分钟，然后检测荧光。使用Griess亚硝酸盐测定试剂盒（仅用于一氧化氮、过氧亚硝酸盐和亚硝酸盐标准品；灰柱）和二氢罗丹明123（DHR 123；白柱）作为产生活性氧的阳性对照。超氧化物歧化酶（SOD）是一种超氧化物清除剂，可作为超氧化物的阴性对照。结果表明，ＭitoSOX Red（黑柱）易被超氧化物氧化，但不易被其他氧化剂氧化。

将组份C用水稀释一倍，并于37˚C预热备用。

1. 取65μL组分B加入组分A中，使之全部溶解，配制成1 mM MitoSOX Red原液；

2. 按1：200的比例，将组分A原液用1×组分C稀释，配制成5μM的工作液（浓度可调，但不可高于5μM, 避免产生细胞毒性效应，包括改变线粒体形态和荧光向细胞核和细胞质的重新分布）；              

3.  取适量工作液浸没或重悬细胞，置37˚C避光孵育10-30min（流式细胞分析则需准备10⁶细胞/mL，每次不少于0.5mL。96孔板每孔200μL）；

4.  用预热的1×组分C轻轻冲洗细胞三次；

5.  （可选）细胞计数如DAPI复染后，冲洗一次；

6.  荧光成像系统、流式细胞仪、荧光酶标仪检测，激发和发射波长510/580nm。