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025-86616616
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Catalog Number:
EGY01411Amount:
25-250次产品简介
EdU法是除同位素法之外，当前最准确的检测细胞增殖方法，是替代Brdu法的革命性突破。
EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶）在DNA合成期掺入DNA双链，EdU炔烃与荧光素叠氮物通过Click反应（一种由铜催化的叠氮物和炔烃的共价反应,亦称点击反应）结合，使掺入EdU的增殖细胞DNA标记上荧光素，通过检测荧光信号，灵敏。快速地检出增殖的细胞(图1)，未增殖的细胞则只标记Hoechst 33342而发出蓝色荧光信号。
本品的特点：
准确性高、灵敏度高： 直接检测DNA合成，相比MTT、CCK8等检测细胞代谢物的间接法更精准，并且减少Brdu法因变性和抗体产生的假信号；
操作简便、快速： 仅需5步60分钟即可完成。比Brdu法减少了变性和抗体标记步骤；
兼容性高：支持多重标记，多指标、多方法检测，EdU法可更好地保存细胞形态、抗原结构和 DNA 完整性，适于固定细胞 用抗体（免疫组化法、免疫细胞化学法）与荧光染料同时标记，适配荧光成像仪、流式细胞仪、荧光光度或酶标仪检测，可同时进行细胞周期等多种标志物的分析。
图1 EdU标记DNA原理
试剂盒组份
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组份 |
EGY01411（25/250tests） |
EGY01412 （50/500tests） |
EGY01413 （100/1000tests） |
保存 |
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组份A：EdU |
1 mL |
2 × 1 mL |
2×2 mL |
-20 ℃ |
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组份B：叠氮荧光素488 |
50µL |
100µL |
200µL |
-20 ℃，避光 |
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组份C：10× Click 反应 Buffer |
2 mL |
4 mL |
8 mL |
2-8 ℃ |
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组份D：CuSO4 |
0.5 mL |
1 mL |
2 mL |
2-8 ℃ |
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组份E：Click Buffer 添加物 |
100mg |
200mg |
400mg |
2-8 ℃ |
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组份F：10× Hoechst 33342 |
35µL |
70µL |
140µL |
2-8℃，干燥 |
规格说明: 按 每张玻片50µL标记液的用量计算，本品可提供250、500、1000张的试剂用量，
按 多孔板每孔500µL标记液的用量计算，本品可提供25、50、100孔的试剂用量。
试剂盒以外自备仪器和试剂
² PBS, pH7.2-7.6
² 固定液（例：3.7%甲醛 in PBS，或戊二醛等）
² 促渗液（例：0.5% Triton X-100 in PBS，或皂苷等 ）
² 清洗液：3% BSA in PBS pH7.4
² 去离子水
² 多孔板和 18 × 18-mm 盖玻片
操作步骤
1、 EdU标记细胞 （即细胞DNA合成时掺入EdU）
1.1 取10 µL 组份A（10mM EdU），加入5mL完全培养基配成EdU标记液（足够染10张细胞爬片），
1.2 将原细胞培养基弃去一半，加入等体积的EdU标记液（注： 此 EdU终浓度为10µM仅供参考，可据细胞类型进行梯度预试验以确定最佳浓度,可参考附表2）；
1.3 细胞继续培养孵育2h；（注：孵育时间取决于细胞生长速率，不同细胞参考附表）
2、细胞固定及促渗
2.1 弃标记液和培养基，每片/孔加入1mL 固定液（3.7%甲醛in PBS），室温孵育15min；
2.2 弃固定液，每片/孔以清洗液（3% BSA in PBS）洗细胞2次；
2.3 弃洗涤液，每片/孔加1mL促渗液（0.5% Triton X-100 in PBS），室温孵育20min。
3、Click反应，使DNA-EdU标记上荧光素
3.1 配制Click反应组份
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组份简称 |
组份全称 |
配制方法 |
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1×组份C |
1× Click反应Buffer |
将组份C用dH2O稀释10倍（4mL组份C加36mL的dH2O） |
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10×组份E |
10×Click Buffer 添加物 |
每200mg组份E 加1mLdH2O溶解，保存于-20℃ 1年，如变棕色失效。 |
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1×组份E |
1×Click Buffer 添加物 |
10×组份E以dH2O稀释成1×组份E，即用即配。 |
3.2 配制Click反应液 （务必按下表的顺序依次添加各组份）
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反应组份 |
反应数目 |
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1 |
2 |
4 |
10 |
25 |
50 |
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1×组份C （1×Click反应Buffer） |
430µL |
860µL |
1.8mL |
4.3mL |
10.75mL |
21.5 mL |
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组份D （CuSO4 ） |
20µL |
40µL |
80µL |
200µL |
500µL |
1mL |
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组份 B （叠氮荧光素488） |
1.5µL |
3µL |
6µL |
15µL |
37.5µL |
75µL |
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1×组份E （1×Click Buffer 添加物） |
50µL |
100µL |
200µL |
500µL |
1.25mL |
2.5mL |
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总体积 |
500µL |
1mL |
2mL |
5mL |
12.5mL |
25mL |
注：每个反应使用500µL的Click反应液，用户可以根据样本调整用量。
3.3 弃促渗液，每片/孔加清洗液（3% BSA in PBS）洗2次；
3.4 弃清洗液，每片/孔加0.5mL Click反应液并摇匀，室温避光孵育30min；
3.5 弃Click反应液，每片/孔加1mL 加清洗液（3% BSA in PBS）洗2次，弃清洗液；
4、Hoechst 33342复染核DNA
4.1 每片/孔加1mL PBS洗1次；
4.2 每片/孔加1mL 1×Hoechst 33342染液（组份F：PBS=1：2000，终浓度为5µg/mL）
4.3 室温避光孵育15-30min，弃Hoechst 33342染液。
4.4 每片/孔加1mL PBS洗2次，弃PBS；
4.5 推荐：此时可多重标记，如标记一抗和二抗， 注意避光；
试剂盒组成与荧光特征
荧光显微镜等成像系统的激光器与滤光片组 按下表选择：
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Hoechst 33342 |
荧光素488 |
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Ex/Em (nm) |
350/461 |
495/519 |
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滤光片组 |
DAPI |
FITC |
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未增殖的细胞核标记Hoechst 33342呈蓝色，增殖细胞EdU-F488单染呈绿色。
附表：
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表1 EdU孵育时间设定参考 |
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细胞系 |
人胚胎细胞 |
酵母细胞 |
人成纤维细胞 |
人宫颈癌细胞 |
人胚肾细胞系 |
人神经细胞 |
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细胞周期 |
~30min |
~3h |
~18h |
~21h |
～25h |
~5d |
|
孵育时间 |
5min |
20min |
2h |
2h |
2h |
1d |
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表2 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考 |
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PubMed ID |
Reference |
Cell line |
Concentration |
Time |
|
18272492 |
Salic A, et al. PNAS. 2008 |
NIH3T3, Hela |
10 nM~10 μM |
1 hr |
|
18521918 |
Cappella P,et al. Cytometry A. 2008 |
HL-60, A2780, U2OS |
1~10 μM |
30 min |
|
18996411 |
Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009 |
Neurospheres |
1~20 μM |
24 hr |
|
19179371 |
Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009 |
Primary fibroblasts |
10 μM |
1,2,4 hr |
|
19253396 |
Warren M, et al. Dev Dyn. 2009 |
Chick embryos |
10 μM~2 mM |
4 hr |
|
19647746 |
Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009 |
Spleen cells |
50 μM |
24 hr |
|
19544417 |
Momcilović O, et al. Stem Cells. 2009 |
Human ES cells |
10 μM |
30 min |
|
20080700 |
Cinquin O, et al. PNAS. 2010 |
emb-30 |
1 μM |
12 hr |
|
20025889 |
Han W, et al. Life Sci. 2009 |
VSMC |
50 μM |
2 hr |
|
20659708 |
Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010 |
ESC |
50 μM |
2 hr |
|
21310713 |
Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011 |
fission yeast strains |
10 μM |
3 hr |
|
20824490 |
Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011 |
EJ cells |
50 μM |
4hr |
|
21248284 |
Yang S, et al. Biol Reprod. 2011 |
GC cells |
50 μM |
2 hr |
|
21227924 |
Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res. 2011 |
U2OS, HT29 |
30 μM |
90 min |
|
21829621 |
Guo T, et al. PloS One. 2011 |
HIT-T15 |
50 μM |
4hr |
|
21980430 |
Zeng T, et al. PloS One. 2011 |
MCF-10A |
25 μM |
2hr |
|
22012572 |
Ding D, et al. Int Orthop. 2011 |
C3H10T1/2 |
10 μM |
24hr |
|
22000787 |
Zeng W, et al. Biomaterials. 2011 |
EPC |
50 μM |
4hr |
|
21913215 |
Xue Z, et al. J Cell Biochem. 2011 |
SGC7901 |
25 μM |
24hr |
|
22016038 |
Peng F, et al. Lasers Med Sci. 2011 |
MSC |
50 μM |
2hr |
|
21878637 |
Li D, et al. J Biol Chem. 2011 |
HCC |
50 μM |
2hr |
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