活性氧ROS荧光探针H₂DCFDA，2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，还原型荧光探针，用于分析活细胞内ROS的活性，ROS包括过氧化氢 (H₂O₂)、羟自由基(HO•)、一氧化氮 (NO)、过氧化自由基(ROO•)、过氧亚硝基阴离子(ONOO–)、单线态氧 (¹O₂)、超氧化物阴离子(•O₂^–)。

原理：探针本身没有荧光，可透过细胞膜，进入胞内后被酯酶水解去乙酰基生成H2DCF，其可被活性氧ROS氧化生成有绿色荧光的DCF（ 2′，7′-dichlorofluorescein），通过检测DCF的荧光强度即可分析出细胞内活性氧的水平。 

检测仪器可用荧光酶标仪、荧光光度仪、流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等，激发波长488nm, 发射波长520nm。

本探针检测本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便，可以测定500-1000个样品。

1. 实验分组、准备细胞、预给药处理（如需要）

实验按设计分成若干组（空白对照组、阴性、阳性对照组、实验组等）：

     培养悬浮细胞或贴壁细胞，新鲜组织样本需制成单细胞悬液，细胞数量根椐检测方法不同参考如下：

流式细胞仪或荧光光度法：每组培养瓶准备5 ×10⁵-10⁶个细胞， 

荧光酶标板法：6孔板10⁴个/ 1mL /孔，24孔板10³个/ 0.5mL /孔，96孔板10²个/ 0.2mL /孔

荧光成像法： 细胞爬片或滴片10⁴个/ 50μL /片，或按上述规格在专用透明平底微孔板上培养并铺满细胞；

需要作用时间长（大于2h）的待测化合物，按设计的浓度预先加入细胞，作用6h、12h、24h等, 而作用时间短的（小于2h）的待测化合物，则在装载荧光探针后再加入细胞，作用15min、30min、60min等。

2. 装载荧光探针:  将阴性对照组、阳性对照组和实验组的细胞培养基离心或吸弃；

将1mg组份A加入 200µL DMSO溶解，配成10mM储液，可分装小份，置-20℃，避光，密封保存3个月；

用37℃预热的HBSS将探针储液稀释1000倍，配成终浓度为10µM的染色工作液（可因细胞类型不同而调整终浓度1-10µM）；

用该染色工作液重悬各组细胞，或直接加到贴壁细胞上，使之浸没全部细胞，置37℃孵育10-30min，使细胞充分装载探针，

3.  活性氧反应：各组用预热HBSS洗涤装载好探针的细胞3次，以充分洗去未进入细胞内的荧光探针；

再加入预热新培养基，置37°C孵育 10-20min，使胞内酯酶水解掉乙酰基并与活性氧发生反应，生成可发荧光的DCF.

4. 检测： 各组实时或按设定好的作用时间点后，上机（荧光成像系统、荧光酶标仪、流式等）检测荧光信号；光谱参数与FITC相同，激发波长488nm, 发射波长520nm，绿色荧光信号。

探针易在空气中氧化，请尽量避免暴露于空气中。

荧光染料易淬灭，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。