利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。在均匀的悬浮介质中通过离心，各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

通过本试剂盒制备的细胞核仍然保持其在细胞内所具有的形状和大小， 是进行细胞核组分亚分级和相关实验的理想材料，是研究蛋白核转位、DNA-蛋白相互作用，以及进行Western Blot和免疫共沉淀的理想材料。获得的线粒体纯度较高，并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能。可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。

低温高速离心机、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）、1.5m L离心管、涡旋振荡器、相差显微镜、PBS

1、 样品的处理

A、 培养细胞裂解匀浆

a、 按照常规方法收集细胞。用PBS洗涤一次细胞并计数， 离心（2000rpm，5min）收集细胞，吸尽上清。每次提取需要5×10⁷个细胞。

b、 加入1.5mL预冷的裂解液重悬细胞，冰浴中孵育10～15min。

                  c、将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，冰浴的过程中用间隙严密的研杵研磨细胞20～40次。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在40%左右即可；如有需要，研磨后可用细胞筛过滤去除未裂解细胞、大的膜碎片等）

d、 转入第2步进行操作。

B、组织裂解匀浆

a、 称取100～200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干。

b、 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。

c、 加入1.5 mL预冷的裂解液，冰浴的过程中用间隙严密的研杵研磨细胞20次。。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在40%左右即可；如有需要，研磨后可用细胞筛过滤去除未裂解细胞、大的膜碎片等）

d、 转入第2步进行操作。

2、 将组织或细胞匀浆液转移到预冷的离心管中，4 ⁰C，1000×g离心3 min，沉淀即为细胞核，线粒体则分布于上清液。

3、 线粒体的提取

a、 在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5mL 溶液C，取第2步得到的上清液0.5mL（溶液C：上清液体积=1：1）沿管壁小心地加入含有溶液C的离心管中，覆盖于溶液C的上层。

b、 4℃离心（15,000×g 10 min）。离心后的上清为胞浆成分，将上清转移到新离心管，沉淀为线粒体。

c、  往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重悬线粒体沉淀，4℃离心（15,000×g 10 min），弃上清。

d、 用50 ～100µL储存液B或合适的缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或−70 ºC保存。

（加入储存液体积的估算：50 µL/每100 mg组织，100 µl/5 × 10⁷个细胞）

4、 细胞核的提取

a、 吸尽第2步中多余的上清得沉淀，加入0.5 mL溶液A重悬沉淀制成悬液。

b、 将另一预冷的新离心管内加入1 mL溶液 B，将步骤4a中制备的悬液吸取置于溶液B之上，4 ⁰C，1000×g离心10min，弃上清，得较纯的细胞核沉淀。

c、 用适量的储存液A重悬细胞核，进行下一步实验或-70⁰C保存备用。

-20℃保存。

1、 为保证获得完整的细胞核，全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。快速完成操作，微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的细胞器。

2、 破碎细胞是关键环节。与组织块相比，细胞特别是贴壁培养细胞较难破壁，必要时将匀浆混合物3次或多次通过针头剪切破碎细胞，或用小容积玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞20~40次。并不时用相差显微镜下检查未裂解细胞应在40%左右。

3、 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

4、  进行Western Blot和2D-胶电泳，可先用小体积的水重悬细胞核沉淀，然后加入样品缓冲液，如果直接用含SDS样品缓冲液裂解核将释放大量粘稠的DNA使样品难以分散。反复加热变性有助于DNA断裂，可通过细针头反复抽吸打断DNA。

5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。