在破碎组织或细胞时加入活化剂，帮助裂解细胞，反复振荡或使用剪切力释放细胞核，然后在温和条件下低速离心收集细胞核。制备细胞核的整个过程在30～60分钟内完成，无需特殊设备，简便易行，重复性好。适用于从组织块、贴壁或悬浮培养细胞制备完整的高纯度细胞核。制备的细胞核仍然保持其在细胞内所具有的形状和大小，是进行细胞核组分亚分级和相关实验的理想材料，是研究蛋白核转位、DNA-蛋白相互作用，以及进行Western Blot和免疫共沉淀的理想材料。

低温高速离心机、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）、1.5m L离心管、涡旋振荡器、相差显微镜、PBS

1、 样品的处理

A、 培养细胞裂解

a、 悬浮细胞可直接离心（2000rpm，5min）收集细胞；贴壁细胞需要消化或机械刮下收集细胞。用PBS洗涤一次细胞并计数， 离心（2000rpm，5min）收集细胞，吸尽上清后，并估计细胞沉淀的体积。每次提取需要1～2 × 10⁷个细胞。通常每1×10⁷个细胞的沉淀体积约100μL。

b、 加入10倍于细胞沉淀体积的冰预冷的裂解液（以1×10⁷为例约1.0ml），振荡重悬细胞。

c、  加入1/20裂解液体积的试剂A约50μL，振荡混合成细胞悬液。

d、 细胞悬液放置冰水浴10～20min，每3～5分钟振荡细胞30s。在相差显微镜下检查游离的细胞核应该达到95%而未裂解细胞应少于5%。否则继续放置冰水浴和强烈振荡，或置于玻璃匀浆器均浆数十次后再镜检。

e、 转入第2步进行操作。

B、组织块破碎和细胞裂解

a、 称取100~500 mg新鲜组织如肝脏等，PBS冲洗，用剪刀剪成碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块的总体积。加入1 ml冰预冷的裂解液。

b、 加入1/20裂解液体积的试剂A约50μl，震荡混匀。

c、 上下研磨组织20次。在相差显微镜下检查游离的细胞核应该达到95%而未裂解细胞应少于5%。否则应继续匀浆。

d、 用滤纸或双层纱布过滤组织匀浆裂解物。

e、 转入第2步进行操作。

2、 将组织或细胞匀浆液转移到预冷的离心管中，4 ⁰C，1000×g离心3 min，沉淀即为细胞核，弃上清。

3、  用10倍于细胞核体积（约0.5 mL ）裂解液重悬细胞核，4 ⁰C，1000×g离心3 min，弃上清。

4、 加入0.5 mL 溶液A重悬沉淀制成悬液。

5、 将另一预冷的新离心管内加入1 mL溶液 B，将步骤4制备的悬液吸取置于溶液B之上，4 ⁰C，1000×g离心10min，弃上清，得较纯的细胞核沉淀。

6、  用适量的储存液重悬细胞核，进行下一步实验或-70⁰C保存备用。

-20℃保存。

1、 为保证获得完整的细胞核，全程低温操作，将样品管放在冰水浴中而不是碎冰块中。快速完成操作，微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的细胞核。

2、 破碎细胞是关键环节。与组织块相比，细胞特别是贴壁细胞较难破壁，必要时将匀浆混合物3次或多次通过针头剪切破碎细胞，或用小容积玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞20~40次。并不时用相差显微镜下检查未裂解细胞应少于5%。

3、 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

4、  进行Western Blot和2D-胶电泳，可先用小体积的水重悬细胞核沉淀，然后加入样品缓冲液，如果直接用含SDS样品缓冲液裂解细胞核，则将释放大量粘稠的DNA使样品难以分散。反复加热变性有助于DNA断裂，可通过细针头反复抽吸打断DNA。

5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。