本品提供双色荧光染料，其中Calcein AM具膜通透性，进入活细胞内后被酯酶水解，由无荧光的Calcein AM 转化为明亮绿色荧光的Calcein，而另一个荧光染料碘化丙啶（PI）则无法透过活细胞膜，只能染死细胞核，使其着红色荧光，二种染料依质膜完整性和酯酶活性，可有效地区分活细胞与死亡细胞。二种染料的Ex/Em分别为：Calcein：494nm/517nm，PI：535nm/620nm。

本品用于区分活细胞与死细胞，可测定一个细胞群体中受损伤细胞的数量，以确定细胞活力和细胞毒性。此方法可替代台盼蓝排除法、⁵¹Cr 释放法等检测细胞活力的方法, 相比之下，本法更快捷、更安全, 更灵敏，更经济，现常应用于如肿瘤坏死因子TNF等生物制剂、细胞毒药物等的高通量筛选，流式细胞术测定淋巴细胞介导的细胞毒性、精子的活力检测、光动力疗法的毒性作用等领域。

本品可应用于大多数真核哺乳动物细胞，包括悬浮细胞、贴壁细胞（如：星形胶质细胞）和某些组织，但不适用于细菌、酵母（可另参选相关产品）。

本品适用于荧光显微镜、荧光微孔板、流式细胞仪等荧光检测系统。

本品提供小包装，方便少量样本的检测，开启后一次使用完毕，避免失效浪费和污染环境。

如需本品中的单个组分、自备材料及类似产品，请参选相关产品。

如需同时区分活细胞、死细胞和凋亡细胞，请参选相关产品。

注：Calcein AM  钙黄绿素乙酰氧甲酯，Propylene Iodide 碘化丙啶（PI）， DMSO二甲亚砜

注：本品标注的1000T/500T/250T适用于荧光显微镜、荧光微孔板，而流式细胞仪可用100T/50T/25T. 

自备材料：PBS，5% saponin皂甙溶液，抗荧光淬灭封片剂

1 、 荧光显微镜

1.1  培养悬浮细胞或贴壁细胞（直接培养于盖玻片或30mm培养皿上），按预案用细胞毒药物处理后，用PBS洗2-3次以去除血清等干扰因素；

1.2  试剂盒每100µg组分A加50µL组份C溶解为A液，每250µg组分B加50µL组份C溶解为B液，，A液和B液各取10µL加入到10mL的PBS中，再加入100µL组份D，涡旋充分混匀，配制成2 µM Calcein AM和8 µM PI的染色工作液。

注：Calcein AM易水解，染色工作液应当天用完。

注：Calcein AM和 PI 的浓度应依据细胞类型不同而调整，以得到最佳效果。一般来说，满足信号足够的前提下，尽可能选择最低浓度。Calcein AM和 PI 推荐浓度范围为 0.1～10µM。

1.3  将染色工作液直接加入贴壁细胞层上并浸没细胞，或用以重悬细胞；

1.4  室温避光孵育 30～45 min（如果染液浓度或温度增高，孵育时间可缩短）；

1.5  贴壁细胞：取10µL PBS滴于洁净载玻片上，用尖镊将盖玻片的细胞面覆盖于载玻片上；

悬浮细胞：滴1～2滴于洁净的载玻片上，盖上盖玻片；

注：为便于观测，可选用抗荧光淬灭封片剂封片。 

1.6 荧光显微镜观测

Calcein AM：滤光片Ex/Em：485±10 nm)/ 530±12.5 nm，绿色荧光，仅染活细胞；

PI：滤光片Ex/Em：530±12.5nm /620±20nm，红色荧光，仅染死细胞。

2 、 荧光微孔板操作

A:  测定和计算活、死细胞相对数量（百分含量）的方法

A.1培养细胞计数、分组、接种，按A.7设对照组，微孔板每孔检测的细胞数最低约200~500个，最高约10⁶个。

A.2  样本组按预设的细胞毒药物处理，死细胞对照组用 0.1%皂苷或0.1~0.5%毛地黄皂苷处理10 min，或70%乙醇处理30 min或补体及相应的IgG处理30 min；

A.3  PBS洗细胞2-3次以去除血清等干扰因素，每孔细胞加入100µL PBS或 PBS细胞重悬液，

A.4  配制染色工作液，与步骤1.2相同；

注：活细胞和死细胞对照组为单染，需分别单独配制1mL 2µM 的Calcein AM（另加入10µL组分D）和1mL 8µM 的 PI。

A.5  每孔加入100µL染色工作液，终体积为200µL，每孔的终浓度 Calcein AM 为1µM， PI为2µM，室温避光孵育 30~45 min：

A.6  荧光酶标仪检测

Calcein AM：Ex/Em：485±10 nm/ 530±12.5 nm，活细胞在530 nm处有强荧光信号；

PI：Ex/Em：530±12.5nm /620±20 nm，死细胞在620 nm处有强荧光信号

A.7  实验分组、计算与说明

活、死细胞的相对数量可用百分含量表示（绝对数量的测定和计算方法参见本节B）。

活细胞的百分含量可依据530nm下荧光值，按如下方法计算：

活细胞（%）= B₅₃₀ - E₅₃₀/ F₅₃₀ –E₅₃₀ ×100%

死细胞的百分含量可依据620nm下荧光值，按如下方法计算：

死细胞（%）= A₆₂₀- D₆₂₀/ C₆₂₀ - D₆₂₀×100%

（在上述计算前，可将空白对照组的G₅₃₀ 和H₆₂₀分别从各组的530 和620 中减去，即扣除背景。）

B  测定和计算活、死细胞绝对数量的方法

本步骤可以在本节A的实验结束时接续进行, 以获取活细胞和死细胞的绝对数量，细胞总数与荧光强度呈线性关系，样本的细胞总数可通过杀死所有细胞、用饱和浓度的PI染色，检测620 nm的荧光来计算而得。

B.1  细胞计数T，按步骤A进行样本染色和检测；

B.2  检测完成后，在样本中加入约2～5µL/孔的5%皂甙溶液（终浓度约0.1%），以杀死样本中所有细胞；

B.3  摇动微孔板混匀，静置10min (或直至信号稳定)；

B.4  荧光酶标仪检测 PI在620nm处的荧光信号，记为T620, 对应细胞总数T。  

激发Ex/发射Em：530±12.5nm /620±20nm， 

B.5 计算活细胞、死细胞的绝对数量

     620 nm处的荧光强度与死细胞数量呈线性关系

死细胞数量=A620/ T620×细胞总数T

活细胞数量=细胞总数T-死细胞数

也可以通过分别建立活、死细胞数与荧光值（530nm）和（620nm）的标准曲线，荧光强度与细胞数成线性正相关，通过测定样本的荧光值计算出活、死细胞的数量。

3 、 流式细胞仪操作

3.1  用DMSO将组分A Calcein AM 稀释80倍（如：加2 µL组分A到 158 µL的 DMSO中），配成50 µM 染色工作液(当天使用完毕) ；

3.2  细胞毒药物处理后的细胞0.1 · 5 × 10⁶个/mL，PBS 洗2·3遍，用1mL PBS重悬细胞；

3.3  在每mL细胞重悬液中加入2 µL 的50 µM Calcein AM染色工作液和0.5 µL的16 mM PI，

3.4  室温避光孵育 15~20 min（尽量缩短孵育时间在1–2 h内）；

3.5  流式细胞仪分析

激发波长488 nm，Calcein AM在FL1（530 nm）通道检测， PI在FL2或FL3通道检测，

设门和用单染细胞按标准方法调节补偿。 

细胞分成二个群，其中活细胞群分布于绿色荧光区；死细胞群分布于红色荧光区（图1）

图1：按试剂盒说明书的方法，对乙醇固定的人B细胞双染，流式细胞仪488 nm激发。双通道检测显示绿色荧光(530 nm) 活细胞群与红色荧光 (620 nm) 死细胞群分离明显。