EdU法是除同位素法之外，当前最准确的检测细胞增殖方法，是替代Brdu法的革命性突破。

EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶）在DNA合成期掺入DNA双链， EdU的炔烃基与叠氮荧光素的叠氮基通过Click反应（一种由铜催化的叠氮物和炔烃的共价反应，亦称 点击反应）结合，使掺入EdU的增殖细胞DNA标记上荧光素（图1），通过检测荧光信号，灵敏。快速地检出增殖的细胞，未增殖的细胞EdU没有掺入而无荧光素标记和荧光信号（图2）。

本品的特点：

    准确性高、灵敏度高： 直接检测DNA合成，相比MTT、CCK8等检测细胞代谢物的间接法更精准，并且减少Brdu法因变性和抗体产生的假信号；

操作简便、快速：  仅需3-6步60-90分钟即可完成。比Brdu法减少了变性和抗体标记步骤

兼容性高：支持多重标记，多指标、多方法检测，EdU法可更好地保存细胞形态、抗原结构和 DNA 完整性，适于固定细胞 用抗体（免疫组化法、免疫细胞化学法、免疫荧光法）与荧光染料同时标记 ， 适配荧光成像系统、流式细胞仪、荧光光度或酶标仪检测，可同时进行细胞周期等多种标志物的分析。

        图1   EdU标记DNA原理

用户自备试剂

 1% BSA in PBS  pH 7.1–pH 7.4                                 

 PBS, 或D-PBS, 或TBS

 去离子水或超纯水

 流式管   

1、 EdU标记细胞  （即细胞DNA合成时掺入EdU）和（可选）标记细胞表面抗体

1.1   培养细胞，于每mL新更换的新鲜培养基中加入1.0µL组份A，使EdU终浓度达10μM。

（注：该浓度仅供参考，标记效果受细胞密度、类型、培养基种类等因素影响，最好预试验确定合适宜的EdU，终浓度一般为1-10μM或参考附表1-2，如果提高浓度，则缩短下步的孵育时间；阴性对照不加EdU，如为血液样本，采血时需用肝素抗凝。）

1.2   细胞继续培养按原条件培养孵育1-2h；

（注： 孵育时间取决于细胞生长速率，可预试验确定或参考附表1）；

1.3   （可选）标记细胞表面抗体：每10⁷个细胞加3mL含1%BSA的PBS洗二遍后，加1mL重悬，取100µL（10⁶个）与标记抗体混合，按抗体标记说明书并避光操作

（注：在第3步click反应标记荧光素之前，不可使用PE, PE-连接物, 或量子点 抗体偶联物，尽快进行2.1步固定细胞）

2、细胞固定及促渗

2.1  细胞加3mL的1%BSA in PBS洗一遍，离心弃上清，于沉淀中加入100µL组份C，室温避光固定15 min；

2.2  离心弃上清，于细胞沉淀中加3mL含1%BSA的PBS洗一遍； 

2.3  离心弃上清，于细胞沉淀中加入100 µL的 1×组份D（组份D用1%BSA in PBS 稀释10倍即得）通透，室温避光孵育15 min或直接进行3.1步的Click反应； 

3、Click反应，使DNA-EdU标记上荧光素 

3.1   配制Click  Buffer 添加物

3.2   配制Click反应液 （务必按下表的顺序依次添加各组份）

3.3  细胞弃通透洗涤液，每管加上述配好的 0.5mL Click反应液并摇匀，室温避光孵育30min；

3.4  离心弃Click反应液，每管加3mL1×通透洗涤液（1×组份D）洗1次；

3.5   细胞沉淀, 选择如下操作：

加500µL 1×通透洗涤液重悬，直接上流式细胞仪（步骤 6）检测，

或加100µL 1×通透洗涤液重悬，选择4.1-4.4 （抗体标记细胞内或表面抗原）、

或加500µL 1×通透洗涤液重悬，选择5.1-5.2（检测细胞DNA含量）

4、（可选） 同时用抗体标记细胞内或表面抗原

4.1   加抗胞内或表面抗原的荧光蛋白(RPE、PE-连接或量子点)偶联抗体，混匀；

4.2   按抗体说明书要求的时间和温度，避光孵育，

4.3   每管加3mL的1×通透洗涤液洗一遍，离心弃上清， 

4.4   细胞沉淀，选择如下操作：

加500µL 1×通透洗涤液重悬，直接上流式细胞仪（步骤 6）检测，

或加500µL 1×通透洗涤液重悬，选择5.1-5.2（检测细胞DNA含量）

5、（可选）同时检测细胞DNA含量

5.1   每管加入PI核DNA染料和RNA酶（按细胞核或细胞周期染料说明书操作）；

5.2   参考细胞核染料说明书，避光孵育10-15min；

6、 流式细胞仪分析

EdU-F488     激发488nm，发射波长530/30nm，

核DNA染料和流式抗体的荧光光谱请参考相关产品说明书。传统流式细胞仪上检测总DNA 含量,收集过程中需使用低流速。DNA含量的染料荧光信号以线性放大方式检测，而Click标记EdU生成的荧光信号最好通过对数放大方式来检测。

图2：  EdU-F647单染 检测增殖细胞           图3：EdU-F647/SYTOX 双染检测DNA含量并区分细胞周期

附：  EdU和BrdU 双标法检测细胞增殖的策略

按如下策略用 EdU 与 BrdU 对培养细胞进行双标：

•  用 EdU 进行首轮标记,  BrdU 用于第二轮标记。

•  用 BrdU 进行第二轮标记时,不需要从细胞培养基中去除 EdU。

•  EdU和 BrdU同时存在时 ，BrdU优先掺入 DNA合成，而 EdU不会

同时掺入, 此特点简化了双标记时通常需要洗涤去除前一标记物的步骤,。

•   在采用验证过的 BrdU 标记方法进行二轮标记后再处理细胞。

•   在 BrdU标记时的 DNA 变性步骤之后,首先进行click反应以标记EdU,

然后按抗体标记方法检测BrdU。

•    选择对 EDU 没有交叉反应的 BrdU 抗体。

图4： EdU和BrdU 双标检测细胞增殖

附表：