线粒体存在于真核细胞中，总量占细胞体积高达 10%。其形态因细胞类型、细胞周期阶段和细胞内代谢状态而变化。线粒体的重要功能是通过氧化磷酸化作用和脂质氧化反应产生能量。线粒体在其它一些代谢有一定的作用，包括尿的生成，血红素、非血红素铁和类固醇的生物合成，以及细胞内Ca²⁺稳态。线粒体还在细胞凋亡过程中起着关键的作用。对于线粒体这些许多功能，人们对其所涉及的成分只了解一部分，而对其机制和调节了解得更少。

本线粒体示踪荧光探针具有细胞膜通透性，其通过氯甲基上温和的巯基反应在纳摩尔水平上标记线粒体，其在线粒体膜上积聚而呈现明亮的荧光，相对于传统的线粒体探针，如：罗丹明123和四氢罗丹明的标记易受膜电位的去极化影响，本系列荧光探针并且不依赖于线粒体膜电位，标记性能更优异和稳定，因而可以用于更宽泛的细胞功能分析，如药物筛选等。

   线粒体红色荧光探针Mito-Tracker Red  CMXRos可标记活细胞，并且在细胞固定之后仍保留在线粒体内不被淬灭，可进行复染，支持后续下游的其它标志物分析。

本探针标记线粒体的实验操作非常简单，细胞与探针共同孵育后即可检测，适用于荧光成像系统、荧光酶标仪、流式细胞仪, 探针分子量和荧光光谱特征如表1：

1.   取94 μL的DMSO（自备）加到预先室温解冻50 μg的Mito-Tracker Red中，配成终浓度为1mM的储液（可于-20ºC或更低温度避光保存）；

2. 取适量1mM的储液用37℃预热的HBSS或不含血清、酚红的培养基稀释至工作浓度。

Ø 线粒体荧光探针的工作浓度通常为25~500nM（应根据细胞类型等因素不同进行调整优化），

Ø 如果染后需要固定和通透处理的细胞，探针的工作浓度为100 nM ~500 nM，例如：配100nM工作液，可取1mM的储液10 μL加到 10 mL 的HBSS或不完全培养基中，即稀释10000倍。

Ø 血清可能使探针氧化导致荧光减灭，HBSS：含 Ca²⁺ & Mg²⁺的Hank`s平衡盐溶液。

3. 培养好的细胞弃去培养基，用37℃预热好的探针工作液重悬（悬浮细胞）或浸没（贴壁细胞），置37℃、避光孵育15–45 min（依据细胞类型或应用不同而进行时间优化）；

4. 染色结束后，弃探针工作液，加入预热的培养基或PBS；

5. 使用荧光显微镜等成像系统、荧光酶标仪或流式细胞仪检测荧光信号，荧光光谱特征见表1，

如果线粒体染色后需要固定和通透细胞进行免疫细胞化学法标记其它分子或结构，请参考如下操作方法：

细胞染色后的固定和通透方法（可选）：Mito-Tracker Red荧光探针在染色后可采用下述方法将细胞进行固定和通透，可取得较好的复染效果。

A  洗涤细胞：线粒体染色完成后，用预热的新配培养基或缓冲液PBS洗涤细胞；

B  固定细胞：小心弃去培养基或者缓冲液，加入新配预热的含2~4%甲醛的培养基，例如：使用Mito-Tracker Red标记内皮细胞的线粒体后，再用含3.7%甲醛的完全培养基在37°C固定15 min；

C  洗涤细胞：固定完成后，细胞用PBS缓冲液洗涤数次；

D  通透处理（可选）：如果细胞在固定后需要进行免疫细胞化学反应时，通透是必须的操作步骤，即可将固定好的细胞与含去污剂如Triton X-100的缓冲液中孵育，例如：内皮细胞用含有0.2% Triton X-100的PBS孵育10分钟，或者在冰冷的丙酮中浸5分钟，再以PBS洗涤。丙酮通透后不可进行抗体标记，其只用于改进信号与背景的信噪比。

E  通透好的细胞，按免疫细胞化学的抗体说明书进行标记和检测。