线粒体存在于真核细胞中，总量占细胞体积高达 10%。其形态因细胞类型、细胞周期阶段和细胞内代谢状态而变化。线粒体的重要功能是通过氧化磷酸化作用和脂质氧化反应产生能量。线粒体在其它一些代谢有一定的作用，包括尿的生成，血红素、非血红素铁和类固醇的生物合成，以及细胞内Ca²⁺稳态。线粒体还在细胞凋亡过程中起着关键的作用。对于线粒体这些许多功能，人们对其所涉及的成分只了解一部分，而对其机制和调节了解得更少。

本线粒体示踪荧光探针具有细胞膜通透性，其通过氯甲基上温和的巯基反应在纳摩尔水平上标记线粒体，其在线粒体膜上积聚而呈现明亮的荧光，相对于传统的线粒体探针，如：罗丹明123和四氢罗丹明的标记易受膜电位的去极化影响，本系列荧光探针并且不依赖于线粒体膜电位，标记性能更优异和稳定，因而可以用于更宽泛的细胞功能分析，如药物筛选等。

   线粒体橙色荧光探针Mito-Tracker Orange CMTMRos、可标记活细胞，并且在细胞固定之后仍保留在线粒体内不被淬灭，可进行复染，支持后续下游的其它标志物分析。

本探针标记线粒体的实验操作非常简单，细胞与探针共同孵育后即可检测，适用于荧光成像系统、荧光酶标仪、流式细胞仪, 探针分子量和荧光光谱特征如表1：

1.   取117 μL的DMSO（自备）加到预先室温解冻50 μg的Mito-Tracker Orange中，配成终浓度为1mM的储液（可于-20ºC或更低温度避光保存）；

2. 取适量1mM的储液用37℃预热的HBSS或不含血清、酚红的培养基稀释至工作浓度。

Ø 线粒体荧光探针的工作浓度通常为25~500nM（应根据细胞类型等因素不同进行调整优化），

Ø 如果染后需要固定和通透处理的细胞，探针的工作浓度为100 nM ~500 nM，例如：配100nM工作液，可取1mM的储液10 μL加到 10 mL 的HBSS或不完全培养基中，即稀释10000倍。

Ø 血清可能使探针氧化导致荧光减灭，HBSS：含 Ca²⁺ & Mg²⁺的Hank`s平衡盐溶液。

3. 培养好的细胞弃去培养基，用37℃预热好的探针工作液重悬（悬浮细胞）或浸没（贴壁细胞），置37℃、避光孵育15–45 min（依据细胞类型或应用不同而进行时间优化）；

4. 染色结束后，弃探针工作液，加入预热的培养基或PBS；

5. 使用荧光显微镜等成像系统、荧光酶标仪或流式细胞仪检测荧光信号，荧光光谱特征见表1，