本品适用于活细胞与固定细胞、组织、动物体内的荧光成像分析，常与DiI组合用于细胞膜、神经元的标记，如直接标记培养的活细胞，可选DiO 细胞膜绿色荧光标记液（EGY025）。

染活细胞前，需将将固体染料配制为染料标记液（配制方法参见备注1）。

1. 悬浮细胞

1.1  以不含血清的培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1X10⁶个/mL；（如果大于10⁷/mL或小于10⁵/mL，则需增加标记时间）

1.2  每1 mL细胞悬液加入适量染料标记液，使终浓度达50 µg/mL，用移液器轻轻混匀；

1.3  37℃孵育1~20min，不同的细胞类型可参考表2，其它类型细胞初始可选择20 min，可在5 min - 2 h间优化；

1.4  37℃，1500rpm离心5 min；

1.5  弃上清，用37℃的培养基悬浮细胞，重复两次离心洗涤；

1.6  加适量预热培养基，37℃放置10 min，进行荧光显微镜成像分析或流式分析，荧光光谱参数详见表1。

2. 贴壁细胞

2.1  细胞爬片至所需的汇合度，吸去培养基，将爬片放到湿盒中；

2.2  每1mL新鲜培养基中加入染料标记液，终浓度50 µg/mL；

2.3  吸取100μL，轻轻滴加并铺匀，使之盖满整个爬片；

2.4  37℃孵育，不同的细胞类型可参考表2，其它类型细胞初始可选择20 min，可在5 min - 2 h间优化；

2.5  吸弃染色液，用新鲜预热的培养基覆盖并孵育10 min，重复洗三次；

         2.6 加抗荧光淬灭剂的介质（不宜使用甘油），荧光成像分析，荧光光谱参数详见表1。

            表2 优化的细胞染色孵育时间

       图1   DiO DiI DiD DiR 荧光光谱

3. 固定细胞或组织切片的标记

对于已用4%甲醛固定后的细胞或组织切片（戊二醛固定的样本往往会产生高荧光背景，不建议使用），可采用DiO固体染料直接标记染色，方法如下：

3.1  4%甲醛固定好的细胞或组织切片，加PBS  pH 7.4， 室温浸没5 min，重复洗三次；不可使用去污剂、促渗剂（如吐温、Triton X-100、NP-40等）和高浓度有机溶剂。

3.2  用枪头直接取固体染料覆盖于样本上，或将染料加DMSO配成1-2.5 mg/mL的高浓度染液（配制方法见备注2），滴数滴于样本上，使之浸没样本，放于湿盒内，

3.3  短染的样本可置37℃，20 min-2 h（自行优化），需要长期染色的样本（如神经元）可置4℃或室温数周时间；

3.4  PBS洗去染液，加抗荧光淬灭剂介质（不宜用甘油）或封片剂，荧光显微镜检测，荧光光谱参考表1  

备注1；染料标记液的配制方法（可选购商品化的染料标记液：EGY025）

取1mg DiO固体染料加入20mL的DMF（dimethylformamide)，加热至50°C并超声直至溶解，于13000 rpm离心10分钟，得上清液，即为染料标记液，或超声溶解后再经由 0.2 µm 过滤，即为染料标记液，计算体积和浓度，使用终浓度50 µg/mL。

备注2 染组织固体染料的配制方法

    DiO加DMSO溶解配制为1-2.5mg/mL高浓度染液。

   即 每5mg固体染料加入2-5mL的DMSO，对于DiO不易溶解的染料，需要加热至50°C并超声处理直至溶解。