DAF-FM DA全称4-Amino,5-aminomethyl- 2’,7’- difluorescein, diacetate， 是最新型的用于一氧化氮定量检测的荧光探针，分子量为496.4，分子式C₂₅H₁₈F₂N₂O₇，本品HPLC分析纯度大于98%，5mM溶于高纯DMSO的淡黄色溶液。

   DAF-FM DA可透过细胞膜，被细胞内的酯酶催化生成微弱荧光的DAF-FM，如胞内存在一氧化氮，则与NO发生反应产生强烈绿色荧光（图1）。

适配仪器：荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪，激发波长495nm，发射波长515nm。

本品使用操作十分简便，并具有更灵敏、更稳定的检测性能。图2为DAF-FM DA在不同浓度（0-1.2µM）一氧化氮存在时的荧光光谱。

本品适于检测细胞内的一氧化氮水平，可以实时检测。

通常按每个反应0.5mL计，可以检测100个样品。

对于被作用时间短(＜2h)的细胞，先装载探针，后加阳性对照及自备化合物作用细胞。对于被作用时间长(＞6h)的细胞，先加阳性对照及自备化合物作用细胞，后装载探针。

1. 按1:1000比例，用本品提供的组份B稀释组份A，使DAF-FM  DA终浓度为5µM（可根据细胞类型在1-10µM间调整）；

2. 装载探针：弃细胞培养液，

贴壁细胞：加入稀释好的DAF-FM  DA，加入体积以能覆盖细胞为宜，通常6孔板每孔加入1mL。

悬浮细胞：加入稀释好的DAF-FM  DA重悬细胞，细胞浓度为10⁶-2×10⁷/mL； 

3. 37ºC细胞培养箱孵育20min（15-60min可调）。 PBS(pH7.4)洗涤细胞三次， 以充分去除未进入细胞内的DAF-FM  DA；

4. 加入阳性对照或自备化合物作用细胞，或把细胞等分成若干份后再加药作用细胞；

5. 上机检测：激光共聚焦显微镜、荧光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪，按FITC设置参数，495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测作用前后荧光的强弱，

BSA和酚红对本荧光探针的检测有干扰，需避免使用，或使用前充分洗去含该组份的培养基。

首次使用如无法一次用完时，请分装成小包装后-20ºC保存，避免反复冻融。 

荧光探针即用即配。配制好的探针工作液应立即使用，不可保存反复使用。 

DAF-FM DA在4ºC、冰浴等较低温度会凝固而粘在管壁内，可以20-25ºC水浴温育片刻至全部融解后使用。 

请穿实验服并戴一次性手套，全程避光操作。