活性氧ROS分析试剂盒由还原型荧光探针H2DCFDA和阳性对照TBHP (tert-butyl hydroperoxide)组成。用于分析活细胞内ROS的活性，ROS包括过氧化氢 (H₂O₂)、羟自由基(HO•)、一氧化氮 (NO)、过氧化自由基(ROO•)、过氧亚硝基阴离子(ONOO–)、单线态氧 (¹O₂)、超氧化物阴离子(•O₂^–)。

H2DCFDA本身没有荧光，可透过细胞膜，进入胞内后被酯酶水解去乙酰基生成H2DCF，其可被活性氧ROS氧化生成有绿色荧光的DCF（ 2′、7′-dichlorofluorescein），通过检测DCF的荧光强度即可分析出细胞内活性氧的水平。

阳性对照TBHP是一种过氧化氢衍生物，能诱导细胞活性氧的产生, 使用终浓度约100 mM，需根椐细胞种类不同调整浓度。

检测仪器可用荧光酶标仪、荧光光度仪、流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等，激发波长488nm,发射波长520nm。

本试剂盒检测本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便，可以测定100-500个样品。

自备：细胞、培养基、PBS、HBSS（Hank's平衡盐溶液）、待测化合物（如有）、培养瓶、培养板或玻片、移液器、离心机、荧光成像或酶标仪等

1. 实验分组、准备细胞、预给药处理（如需要）

实验可按各用户方案分成若干组（如空白组、阳性、阴性对照组、给药组等）；

   培养悬浮细胞或贴壁细胞，新鲜组织样本需制成单细胞悬液，细胞数量根椐检测方法不同参考如下：

流式细胞仪或荧光光度法：每组培养瓶准备5×10⁵-10⁶个细胞， 

荧光酶标板法：6孔板10⁴个/1mL/孔，24孔板10³个/0.5mL /孔，96孔板10²个/0.2mL/孔

荧光成像法： 细胞爬片或滴片10⁴个/50μL /片，或按上述规格在专用透明平底微孔板上培养并铺满细胞；

需要作用时间长（大于2h）的待测化合物，按设计的浓度预先加入细胞，作用6h、12h、24h等, 而作用时间短的（小于2h）的待测化合物，则在装载荧光探针后再加入细胞，作用15min、30min、60min等。

2. 装载荧光探针:  将阴性对照组、阳性对照组和实验组的细胞培养基离心或吸弃；

将组份A按1:1000用37℃预热的HBSS稀释，配成终浓度为10µM的染色工作液（可因细胞类型不同而调整终浓度1-10µM）；

用该染色工作液重悬各组细胞，或直接加到贴壁细胞上，使之浸没全部细胞，置37℃孵育10-30min，使细胞充分装载探针，

3.  活性氧反应：各组用预热HBSS或 HEPES洗涤装载好探针的细胞3次，以充分洗去未进入细胞内的荧光探针；再加入预热新培养基，置37℃孵育10-20min ，使胞内酯酶水解掉乙酰基并与活性氧发生反应，生成可发荧光的DCF.

4. 阳性对照组：取3.2 µL的组份B加到496.8 mL的PBS中，配成50 mM的B储液，在阳性对照组/孔中，按每mL培养基加入4uL的B储液，使其终浓度达到200µM，在正常培养条件下孵育30-60min,；

实验组处理（或有）：在细胞培养基中加入不同浓度待测化合物，正常培养条件下作用既定的时间.

5. 检测： 各组实时或按设定好的作用时间点后，上机（荧光成像系统、荧光酶标仪、流式等）检测荧光信号；光谱参数与FITC相同，激发波长488nm,发射波长520nm。

四、用户自备与操作注意事项

    自备：细胞、培养基、PBS、HBSS（Hank's平衡盐溶液）、待测化合物（如有）、培养瓶、培养板或玻片、移液器、离心机、荧光成像或酶标仪等、

试剂组份密封保存，即开即用，不得打开后保存。

各步尽量避光操作。

如筛选抗氧化剂待测化合物，建议预先检测待测物的荧光光谱或设立样品对照组，避免自发荧光引起实验误差