蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，简称WB，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。在蛋白质进行SDS-PAGE电泳后，利用碧波Western Blotting 检测试剂盒可以完成转膜，膜的封闭，一抗孵育，二抗孵育和ECL化学发光检测的工作。

可调移液器、垂直板电泳仪、X光片、双蒸水、一抗，无水甲醇，显影液，定影液

1、 工作液的准备：

转膜缓冲液配制（1000ml）：

100ml 10×转移缓冲液＋700ml去离子水＋200ml无水甲醇，可重复使用一次。

洗涤液的配制（300ml）：

30ml 10×洗涤液＋270ml去离子水＋150ul Tween 20

封闭液的配制（20ml）： 

20ml洗涤液＋0.6g BSA

2、 转膜

a、 PVDF膜及滤纸的预处理：

转膜前，裁剪与胶大小一致的PVDF膜泡入甲醇中，时间约为1min，小心取出膜放入蒸馏水中浸泡2min，然后把膜放置盛有转膜缓冲液的小槽中平衡15min，同时把已裁剪好的滤纸（与胶大小一致）和海绵也放入盛有转膜缓冲液的小槽中平衡15min。

b、 转膜

（1）、干式电转印

将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张经转膜缓冲液平衡好的1mm厚的滤纸，将经转膜缓冲液平衡好的PVDF膜放在滤纸上，再将凝胶平放在PVDF膜上，最后在凝胶上加盖三层经转膜缓冲液平衡好1mm厚的滤纸， 接通电源，15V进行恒压，转膜的时间根据蛋白分子量的大小而调整，分子量为40－100KD的蛋白转膜30-45min。

（2）、湿式电转印

打开电转夹，每侧垫上一块专用的转膜缓冲液平衡好的海面垫，再各放三块经转膜缓冲液平衡好的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与PVDF膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将经转膜缓冲液平衡好PVDF膜平放在凝胶上，按照 (-) 夹板-海棉-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-夹板 (+)装好，除尽气泡，夹好电转印夹。 电泳槽（槽的一边放一块冰来降温）加满预冷的转膜缓冲液，插入电转印夹，连接好电极，接通电流，转印夹的PVDF膜应对电泳槽的正极， 100v恒压进行转膜，，转膜的时间根据蛋白分子量的大小而调整，分子量为40－100KD的蛋白转膜60min。

3、 膜的封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

用滴管等吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐使用侧摆摇床或类似仪器，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。

4、 一抗孵育

参考一抗的说明书，按比例用封闭液稀释一抗。可用10×10cm杂交袋进行一抗孵育，所需一抗孵育约为1.0ml，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。取出膜，加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。

5、 二抗孵育

根据一抗的类型，选择合适的二抗并参考二抗的说明书，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗； 并按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗（1:10000左右）。可用10×10cm杂交袋进行二抗孵育，所需二抗孵育约为1.0ml，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。用滴管吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次5-10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6、 ECL化学发光检测

a、 ECL工作液的配制：

取1.5ml的eppendorf管，加入500μL A液和500μL B 液，然后加入1μL增强剂，混匀后即为ECL工作液（配制后请尽快使用）。用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。

b、 根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml ECL工作液的比例，滴加ECL工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1-2分钟。

c、 取膜，弃ECL工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，小心赶尽气泡。

d、 将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片30秒，1，3，5分钟，然后一起显影定影观察结果。

PVDF膜室温保存；二抗-20℃保存；其余组份4℃保存。

1、 转膜过程中，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

2、 转膜的操作要点：

将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

  要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（可边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）

并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触（接触后会发生短路）。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

3、 20×A液和20×B液在吸取过程中必须要更换枪头，A液和B液相互污染后会导致A液或B液逐渐失效，影响后续的使用效果。

4、 各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。

5、 A液和B液均对人体有害，操作时请注意适当防护。

          6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。