Western及IP细胞裂解液（Cell lysis buffer for Western and IP）是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀（immunol precipitation，IP）和免疫共沉淀（co-IP）等。

Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，1% Triton X-100，以及多种蛋白酶及磷酸酶抑制剂，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不建议使用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

低温高速离心机、可调移液器、玻璃匀浆器（组织样本）、、1.5m L离心管、涡旋振荡器、PBS

（一）、对于细胞

1、 Western Blot及IP细胞裂解液工作液的准备

            在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF混匀。冰上保存数分钟待用。

2、 样品的处理

A、 悬浮细胞

a、 离心（2000rpm，5min）收集细胞，尽最大努力吸尽上清。

b、 用PBS洗一遍，离心（2000rpm，5min）吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

c、 转入第3步进行操作。

B、 贴壁细胞

a、 培养好的细胞吸去培养基后，加入10mL冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液

b、 用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（不含胰酶）处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。

c、 将细胞溶液转至新的冰冷离心管中，离心（2000rpm，5min）吸尽上清。

d、 用PBS洗一遍，离心（2000rpm，5min）吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

e、 转入第3步进行操作。

3、 加入上述配制好的冷裂解液工作液加入量如下表所示：

           4、 置于冰上，冰浴15 min，中途振荡两次。

5、 离心（12,000rpm，4℃）15min，取上清为蛋白提取物，蛋白定量（建议用BCA法）。

6、 分装保存于-20℃（短期内使用）或-70℃（长期保存），避免反复冻融。

（二）、新鲜组织

1、 Western及IP细胞裂解液工作液的准备

      在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF混匀。冰上保存数分钟待用。

2、 称取100 mg左右的新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干。

3、 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片，放置于玻璃匀浆器中。

4、 加入0.5～1 mL冰预冷的裂解液工作液，冰上研磨组织20次。

5、 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，冰浴放置15min。

6、 离心（12,000rpm，4℃）15min，取上清为蛋白提取物，进一步进行蛋白定量（建议用BCA法）。

7、 分装保存于-20℃（短期内使用）或-70℃（长期保存），避免反复冻融。

  -20℃保存，一年有效。

1、 为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

2、 需自备PMSF。

3、 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

4、 有的样本要通过一些预实验来摸索最佳的实验条件。

         5、一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想，则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐，建议使用透析液透析后的样品进行后续分析。

6、 请穿实验服并戴一次性手套操作。