在细胞生物学研究过程中经常要研究细胞的不同组份，而研究最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting、免疫共沉淀、Western Blot、报告基因检测以及酶活性测定等后续蛋白质研究等。

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟即可完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。

本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

低温高速离心机、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）、1.5m L离心管、涡旋振荡器、相差显微镜、PBS

1、样品的处理

A、 细胞

a、 悬浮细胞可直接离心（2000rpm，5min）收集细胞；

b、 贴壁细胞需要消化或机械刮下收集细胞。用PBS洗涤一次细胞并计数， 离心（2000rpm，5min）收集细胞，吸尽上清后，并估计细胞沉淀的体积（PCV）。每次提取需要5×10⁶～1×10⁷个细胞。通常每1×10⁷个细胞的沉淀体积约100μL。

c、 转入第2步进行操作。

     B、组织

a、 称取100~500 mg新鲜组织如肝脏等，PBS冲洗，用剪刀剪成碎块放入小容量玻璃匀浆器内。

b、 加入适量的冰冷PBS均浆后，静置5 min ，弃沉淀，小心吸取上清转移至另一离心管中。

c、 上清4℃离心（2000rpm，5 min），弃上清，估计细胞沉淀的体积（PCV）

d、 转入第2步进行操作。

2、工作液的准备

溶液A工作液：

       每mL溶液A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，1μL蛋白酶抑制剂。

溶液C工作液：

        每mL溶液C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，1μL蛋白酶抑制剂。

3、在第1步中获得的细胞沉淀每20μL细胞沉淀的体积，加入200μL预冷的溶液A工作液，最大转速涡旋剧烈振荡10s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间）。

4、放置冰上10～15min。

5、加入11μL冷溶液 B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min。

6、再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4℃离心（13000rpm，5min）。

7、立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。)

8、对于沉淀，完全吸尽残余的上清。在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的溶液C 工作液，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上30min，每间隔3 min涡旋剧烈振荡15 seconds。

9、4℃离心（13000rpm，10min），尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白。

10、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（建议用BCA法），分装并保存于-80℃，避免反复冻融。

-20℃保存，一年有效。

1、 为保证获得完整的细胞核，全程低温操作。快速完成操作，微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的细胞核。

2、 PMSF要在裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中不稳定而失效。

3、 本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果较差。

4、 细胞的数量应不少于0.5×10⁷个/mL。

5、 操作规程中各缓冲液的使用量是以20μL细胞压积为例，如细胞压积不同，请参考下表加入各缓冲液。提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂。

       6、一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想，则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐，建议使用透析buffer透析后进行后续分析。

7、 请穿实验服并戴一次性手套操作。