本试剂盒用于从哺乳动物组织或细胞中提取线粒体蛋白。其原理首先是从动物组织或细胞中分离出完整而且纯化的线粒体，然后用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液裂解线粒体得到高纯度的线粒体蛋白。

本试剂盒可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。

低温高速离心机、剪刀、微量移液器、1.5m L离心管、涡旋振荡器、相差显微镜下、PBS

（一）线粒体的提取

1、 样本的处理

A、 培养细胞裂解匀浆

a、 按照常规方法收集细胞。用PBS洗涤一次细胞并计数， 离心（2000rpm，5min）收集细胞，吸尽上清。每次提取需要5×10⁷个细胞。

b、 加入1.5mL预冷的裂解液1重悬细胞，冰浴放置10～15min。

                 c、将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃～4℃冰浴研磨细胞30～40次。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可）

d、 转入第2步进行操作。

B、组织裂解匀浆

a、 称取100～200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干。

b、 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片，放置于玻璃匀浆器中。

c、 加入1.5 mL冰预冷的裂解液1，冰浴上研磨组织20次。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可）

d、 转入第2步进行操作。

2、 将细胞或组织匀浆物转移到离心管，4℃，800×g离心5 min。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底。

3、 在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5mL 溶液A，将匀浆后的上清液0.5mL（溶液A：上清液体积=1：1）沿管壁小心地加入预冷的离心管中，覆盖于溶液A的上层。

4、  4℃离心（15,000×g 10 min）。离心后的上清为胞浆成分，将上清转移到新离心管，沉淀为线粒体。

5、 往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重悬线粒体沉淀，4℃离心（15,000×g 10 min），弃上清。

（二）蛋白的提取

1、 裂解液2工作液的准备

       在每1mL 冷裂解液2加入10μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。

2、 每20μL线粒体压积中，加入200μL上述配制好的冷裂解液2工作液。

3、  置于4℃摇床平台上，温和振荡15 min。

4、  离心（12,000rpm，4℃）15min，取上清为线粒体蛋白提取物，进行蛋白定量（建议用BCA法）。

5、 分装保存于-70℃，避免反复冻融。

  -20℃保存，一年有效。

1、 全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。

2、 微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。

3、 在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细 

      胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。

4、 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。相对离心力RCF值(g值)取决于转子的转速（rpm）和旋转半径（r,以mm计算），可用如下公式表示：RCF=1.11×10^-6(rpm)²×r。

5、 进行Western Blot和2D电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。

6、 PMSF一定要在裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中不稳定而失效。

7、 本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果较差。

8、 提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂。

9、 请穿实验服并戴一次性手套操作。