CFSE（CFDA SE）是最经典的流式分析细胞增殖与追踪的试剂，其在研究自然杀伤（NK）细胞，B细胞，T细胞，胸腺细胞，淋巴细胞，成纤维细胞和造血细胞、肝细胞、胚胎细胞等的增殖和追踪、细胞聚集与粘附、神经突生长、细菌增殖等具有广泛应用，其中最突出和经典的二个应用：一是在细胞疗法研究中标记体外培养移植的免疫细胞，二是用流式细胞标记与追踪细胞分裂的代次。 

CFSE全称羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate, Succinimidyl Ester), mixed isomers，或（5（6）-CFDA，SE），分子式：C₂₉H₁₉NO₁₁，分子量：557.47。

CFSE本身无色亦不发荧光，其可扩散至细胞内，其乙酸酯基团-DA SE被细胞内酯酶裂解，在波长492 nm激发时，释放的荧光素基团 517nm明亮绿色荧光，其羧基与细胞内蛋白质的氨基发生反应，生成染料-蛋白质加成物，使细胞均匀和稳定着绿色荧光，而过量的未结合的试剂则被动地扩散到细胞外培养基中，可被完全培养基淬灭并洗去。

CFSE荧光素-蛋白加成物无论是的细胞分裂和迁移时都能很好地保留在细胞中，胞内荧光信号非常均匀和稳定，而每分裂一次其子代细胞的荧光强度减半，并在子代细胞中仍保持荧光均匀和稳定，据此特征可追踪细胞分裂多达数代或数周，有报道CFSE流式细胞分析追踪淋巴细胞8-10代，用于追踪在无生长条件下地下水中的活细菌至少28天，肝移植后20天仍可清晰地在荧光显微镜下检测到信号。

图  CFSE标记和流式细胞术追踪单核细胞经激活发生异步分裂7代的荧光

X轴以指数形式表示荧光强度，Y轴表示细胞占最大数量的百分比，1-7峰代表细胞分裂连续的7个代次，B代表阴性未经激活的亲本细胞，B和第1代荧光信号最强，第1代细胞数量占比最少，第7代荧光信号最弱，但细胞数量占比最多。

细胞标记CFSE后再用甲醛或戊二醛固定后依然具有反应活性，可使用染料抗体进行随后的免疫组化标记和检测。

细胞标记CFSE适于流式细胞仪、 荧光显微镜等成像系统、 荧光酶标仪分析。

CFSE易吸湿水解，不易长期保存，本品（200T规格）包含十个一次性小管CFSE固体冻干粉和一管高品质无水二甲基亚砜（DMSO），每50µg可标记约20个流式细胞样本，以方便用户酌量使用而不浪费试剂。

1. 配制CFSE原液

每50 µg的CFSE加入18μL的DMSO，溶解配成5mM的原液，于24小时内使用完毕，不宜储存。

2. 配制CFSE工作液

用PBS将5mM CFSE原液（1000X）稀释至5µM的工作液，即每mL PBS加入1μL的CFSE原液，18μL原液可稀释成18mL的标记工作液，将工作液置37℃预热。

（注：超过约三天的长期染色或快速分裂的细胞需5-10μM较高浓度的CFSE。对于较短期实验，如活力测定，则需0.5-5μM较低浓度的CFSE。为保持细胞生理正常并减少过载干扰，染料浓度应该保持尽可能低的水平，最好根据具体细胞类型进行滴定，以确定最合适的浓度。使用显微镜观测可能需要比上述流式细胞高五倍的浓度。）

3、细胞标记

    悬浮细胞：离心收集，每10⁶个细胞加1mL 37℃预热的标记工作液重悬，避光、室温或37℃孵育20min，其间轻摇数次；

    贴壁细胞：弃培养基，加入37℃预热的标记工作液，避光、37℃孵育20min。

4、悬浮细胞：离心收集, 加入标记工作液5倍体积的新配37℃预热培养基, 37℃孵育5min；（去除游离染料）

   贴壁细胞：弃标记工作液，用新配37℃预热培养基洗二次。

5、悬浮细胞：离心收集，加入新配37℃预热的完全培养基，37℃继续孵育15-30min（使染料醋酸根水解）；

贴壁细胞：加入新配37℃预热的完全培养基，37℃继续孵育15-30min。

6、接续的实验，如细胞刺激、加药、培养、固定、通透、其它标记或分析

如需用流式追踪细胞的分裂代次，则培养时间至分裂代次的完成，可长达数天甚至数周。

如需固定和通透，则将标记CFSE后的细胞加入PBS洗一次，使用醛类固定剂，如多聚甲醛，室温、避光固定15-20 min，可使用常规通透剂进行通透，通透后再用PBS洗涤细胞，进行后续分析。

如需进行其它标记，将标记CFSE后的细胞用后续标记物推荐的缓冲液重悬，再进行标记，包括免疫表型、DNA含量、凋亡或其它推荐的染料。

7、分析

流式细胞仪：用488nm波长激发，530 nm FITC通道（FL1）检测分析。对于细胞分裂代次的追踪，建议将标记等量未分裂的亲本细胞作为阴性对照同时检测，以示增殖前的初始细胞荧光峰的位置和数量。

荧光显微镜等成像系统： 滴加抗荧光淬灭剂的介质，激发并用FITC滤光片观察拍照、分析。

荧光酶标仪：可以定量活细胞数，但需建立接种细胞密度的标准曲线，以确保荧光信号在线性范围内并与细胞数成正比。

1. CFSE即用即配，其易被水解，配制成5mM原液后，在24小时内使用完毕。

2. 使用高品质无水DMSO溶解，操作需戴手套注意防护。

3. CFSE需避光操作和保存。

4. CFSE染料易与氨基反应，不应与含氨缓冲液（如 基于Tris的缓冲液）或聚赖氨酸涂层培养容器或载玻片一起使用。