一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简

便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

本试剂盒有如下优点：

1、 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

2、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

3、快速：仅需约1-2个小时即可完成。

4、操作简单：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。

5、应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

二甲苯、多聚甲醛、PBS、H₂O₂ 、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸、荧光显微镜

A、 检测样本的预处理

TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件，如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。

1、 对于细胞样本

a、 把准备好的细胞涂片或爬片自然晾干。

b、 把晾干的样本浸入固定液，室温（15-25℃）固定15-60min。

（固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）

c、 把固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

d、 把c步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

（封闭液的配制： 3%H₂O₂溶于无水甲醇）

e、 把d步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

f、 把e步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min。

（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）

g、 然后转入B步骤标记反应。

     注意事项：

a、 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

b、  固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟～一晚，以改善细胞的渗透性。

c、  使用PBS漂洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。

d、 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。

2、 对于石蜡切片

a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合

 （如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））

b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

c、 把b步处理好的样本加入蛋白酶K工作液， 21-37℃作用15-30min。

（蛋白酶K工作液的配制：2μL 50×蛋白酶 K＋98μL PBS）

d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

（封闭液的配制： 3%H₂O₂溶于甲醇）

f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。

g、 然后转入B步骤标记反应。

     注意事项：

a、 蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理5分钟。（本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。

b、 其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：

替代方法1:

将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）

替代方法2：

 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于HCl  PH2；胰蛋白酶溶液的配制：0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）

替代方法3:

 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

c、 使用酶处理切片时一定要把酶洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

3、 对于冷冻切片

a、 把冰冻切片浸入固定液，室温（15-25℃）固定30min。

  （固定液的配制：4%多聚甲醛溶于PH7.4的PBS中，需新鲜配制）

b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次15min。

c、 把b步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

（封闭液的配制： 3%H₂O₂溶于甲醇）

d、 把c步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。

e、 把d步处理好的样本浸入通透液中，冰上（2-8℃）促渗2min

（通透液的配制：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）

f、 然后转入B步骤标记反应。

     4、对于难处理的切片

a、 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合

 （如：二甲苯脱蜡2次，每次5-10 min；乙醇水合（将脱蜡好的的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇2min））

b、 把a步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5min。

c、 把b步处理好的样本加入浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH= 6 的塑料盒中，置于微波炉中750W（高档）处理1 min

d、 迅速加入80ml双蒸水（20-25℃）加入c步处理好切片的塑料盒中，冷却至室温， 将组织切片转移至PBS（20-25℃）中。

e、 把d步处理好的样本浸入封闭液中，室温（15-25℃）封闭10min。

 （封闭液的配制： 0.1M Tris-HCl PH 7.5、3%BSA、20%小牛血清）

f、 把e步处理好的样本浸入PBS漂洗2次，每次10min。

g、 然后转入B步骤标记反应。

     5、 阳性对照及阴性对照的准备

TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此需要按下述方法准备两个样本来制备阳性及阴性片，其后续步聚与待测样本同样进行。

        a、 阳性对照样本的准备

           组织样本在蛋白酶K处理、PBS浸洗后，细胞样本在Triton X-100通透液处理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反应液（用户自备）室温—37℃处理10 -30 min，其余步骤均相同。

（DNase I反应液的配制：10u-3000u DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl_2, 10mM CaCl₂）

     b、 阴性对照样本的准备

          在标记反应的过程中不添加TdT酶反应液，其余步骤均相同。

B、标记反应：

     1、预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。

      2、配制TdT酶反应液：

  参考下表配制适当量的TdT酶反应液（根据需要按照比例放大），需充分混匀。注意：配制好的TdT酶反应液必须一次使用完毕，不能冻存。

     3、每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）

     4、 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。

      5、荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

操作注意事项：

        1、PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。

         2、在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

         3、TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

*TdT dilution buffer：100mM乙酸钾（pH6.8）， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol 

-20℃保存，荧光标记液需避光保存。

1、TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

2、极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。

3、使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。

4、因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心。

5、为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。

6、 TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。