线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件, 它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。   

JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ∆Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) (Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测。

JC-1单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。

流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、移液器、1.5m L离心管、载玻片、盖玻片、PBS、灭菌双蒸水

1、JC-1染色工作液的配制：

a、取100μL 10×染色结合液加900μL灭菌双蒸水稀释成1×染色结合液，混匀并预热至37℃；

b、吸取500μL 1×染色结合液，加入1μL JC-1，剧烈Vortex充分溶解，混匀配成JC-1工作液；

c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通过离心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的颗粒，吸取离心后的上清使用，以消除干扰。离心后的上清为JC-1工作液

2、用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组和阳性对照组【用适当的凋亡诱导剂，诱导适当时间后经其它检测（如AnnexinV或 Caspase 3活性）证实确有凋亡产生】，收集细胞；

3、用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min），收集不多于1×10⁶的细胞；

4、取500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育15~20min；

5、室温离心（2000rpm，5min）收集细胞，用500μL 1×染色结合液洗涤两次；

6、吸取500μL 1×染色结合液重新悬浮细胞；

7、荧光显微镜观察或流式细胞仪分析。

               A、荧光显微镜观察

         1、滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；

          2、对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；用PBS洗涤细胞两次；

滴加100μL JC-1工作液，加盖玻片，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育15~20min；1×染色结合液洗涤1~2遍；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察；

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

B、流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。正常细胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化，试验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和阳性对照组，根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置。

-20℃保存。JC-1需避光保存，并尽量避免反复冻融。J染色结合液也可4℃保存

1、JC-1在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2、对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代染色结合液孵育染色及洗涤，或延长观测时间。

3、流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。

4、加入JC-1并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。

5、组织需先制备单细胞悬液或提取纯化线粒体后方可进行检测。

6、如果发现染色结合缓冲液中有沉淀，必须全部溶解后才能使用。

7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。