小鼠腹水纯化的目的是尽量除去腹水中与目的抗体不相关的干扰成分，以防止抗体外的其他腹水成分对试验结果产生影响，或提取相应的免疫球蛋白。蛋白G（Protein G）是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，可用于多种抗体的分离纯化。在与不用的免疫球蛋白亚类的结合特性上，Protein G 对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与Protein A很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。G蛋白被固定在介质上与腹水中的抗体相结合，进一步通过洗脱从而从腹水中分离IgG和IgG亚家族抗体。

试剂一：Protein G填料6ml×1瓶；

试剂二：清洗缓冲液50ml（10×）×3瓶，使用时按清洗缓冲液：蒸馏水=1:9的比例进行配制后使用（即10倍稀释）；

试剂三：结合缓冲液500ml×1瓶；

试剂四：洗脱缓冲液250ml×1瓶；

试剂五：再生缓冲液100ml×1瓶；

试剂六：中和缓冲液10 ml×1瓶；

耗材：PD-10柱子×2个

离心机、紫外分光光度计（260nm波长）、移液器、0.45um的滤膜（CAT#: E1AP0011）、透析膜（分子量：14000）（CAT#: E1AP0012）、PEG2000（CAT#: E1AP0013）

1.纯化柱制备

（1）先打开PD-10柱子上盖，取出盖膜。清洗缓冲液（试剂二10倍稀释后使用）清洗3次，每次5ml。

（2）用胶带或支架固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。

（3）在PD-10空柱子里加入2ml的结合缓冲液（试剂三）。

（4）再将试剂一填料混匀后加入PD-10空柱子中，每个柱子3ml，让填料自然沉降，盖上盖膜。

2.平衡柱子：用100ml结合缓冲液过柱。

3.样品准备：将小鼠腹水3000rpm，10min离心两次取上清，再与结合缓冲液（试剂三）按照1：1混合，用0.45um的滤膜过滤混合液（防止堵塞柱子）。

4．上样：将准备好的腹水样品上样，缓缓加入制备好的PD-10 纯化柱中，避免用力过大吹起填料。(可以收集流出液，可以根据需要将此流出液重复过柱，以防止抗体损失)

5．洗脱杂蛋白：用结合缓冲液（试剂三）冲洗柱子，直至流出液中不含蛋白，用紫外分光光度仪检测（260nm）吸光度值小于0.003（也可根据实验要求自行决定合适的吸光度值）。

6. 抗体收集管中预先加入约150ul 的中和缓冲液（试剂六）。

7. 收集抗体：用洗脱缓冲液（试剂四）过柱，收集洗脱液（约2-3ml/管，约收集15-20管左右），直至洗脱液中不含蛋白（紫外分光光度仪检测260nm吸光度值小于0.003）。测定各收集管中的蛋白含量（紫外分光光度仪检测260nm吸光度值有个先上升再下降的过程，吸光度值越高表示抗体浓度越高），合并含抗体浓度较高的收集管，调节pH值至7.0-7.2。用透析膜收集合并抗体并密封两端，放入1000ml清洗缓冲液（试剂二10倍稀释后使用）透析过夜。

7.柱子再生：用70 ml再生缓冲液（试剂五）再生柱子，四度保存 。

备注：如柱子长久不用，把再生过的填料浸泡于20%乙醇即可。使用时用再生缓冲液再生填料。

8. 透析后收集抗体并检测抗体浓度。蛋白浓度（mg/mL）=（1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm）×样品稀释度，式中1.45与0.74为常数。）若抗体浓度过低（小于0.5 mg/ml），可将抗体装入透析袋中，透析袋表面覆盖PEG2000进行浓缩(一般体积浓缩一半，抗体浓度提高一倍)。或采用BCA蛋白浓度测定试剂盒 （CAT#: E1WP2012）检测抗体浓度。

冰袋运输。4℃保存，六个月有效。

1.柱子避免干燥，防止气泡进入。

2.加任何液体时缓缓加入PD-10 纯化柱里，避免用力过大吹起填料。

3.收集的抗体需要调节至中性。

4.请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表