Caspase 9活性分光光度法检测试剂盒(Caspase 9 Activity Colorimetric Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 9酶活性或纯化的Caspase 9酶活性的试剂盒。

 Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 9也称ICE-LAP6或Mch6，有时被写作caspase-9或caspase9，是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。线粒体释放细胞色素c以后，caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。Caspase 9也称FLICE、MACH或Mch5，有时被写作Caspase-9，通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活。Caspase 9被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。Caspase-9 在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，它被激活。

Caspase-9 活性分光光度法检测试剂盒就是将Caspase-9 序列特异性的多肽Ac-LEHD-pNA (acetyl-Leu-Glu-His-Asp p-nitroanilide)偶联至发色基团：pNA (p-nitroaniline)；当该底物被Caspase-9 剪切后，黄色基团pNA即游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，考察Caspase-9 的活化程度。pNA在405nm附近有强吸收。

本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织Caspase-9 活性的检测。

低温高速离心机、酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿）、微量移液器、玻璃匀浆器（组织样本）,1.5m L离心管、PBS、蛋白定量试剂及仪器

1、 准备工作：

 a.、裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。

b、裂解液工作液的准备：使用前每50μL 裂解液加入0.5μL DTT

c、2×反应液溶解后混匀并置于冰浴上备用

2、 样品的处理

a、对于悬浮细胞

把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，离心（2000rpm，5min）收集细胞，小心吸除上清，

同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s；或冻融2～3次。下转第3步进行实验。

 b、对于贴壁细胞

按常规的方法用胰酶消化贴壁细胞，并收集细胞。用PBS洗涤一次，吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s；或冻融2～3次。下转第3步进行实验。

 c、对于组织样品

每50mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入50μL 冰冷裂解液工作液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。下转第3步进行实验。

3、 4℃ 离心（12，000rpm， 10～15min）。

4、 小心吸取上清（含裂解的蛋白质）转移至新的管中，并放置冰上待用。

5、 立即测定Caspase 9的酶活性或-70℃保存样品，同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。

6、 Caspase 9酶活性的检测：

          a、取出适量的Ac-LEHD-pNA  和2×反应液，置于冰浴上备用。

          b、使用前每50μL 2×反应液加入0.5μL DTT。

          c、吸取50μL含100~200μg蛋白的细胞或组织裂解上清；如体积不足50μL用裂解液补足至总体积50μL（各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较）。

          d、如下设置反应体系：

          e、加入Ac-LEHD-pNA后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育4hr。发现颜色变化比较明显时即可测定A₄₀₅。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。

          f、用酶标仪或分光光度计（100μL的比色皿）在λ=405nm或400nm测定其吸光值。

          g、通过计算OD_诱导剂/OD_阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-9 活化程度。

7、 参考Chemicon公司的Caspase 9酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEHD-pNA  per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA 产生1nmol pNA的Caspase 9的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase 9。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育4个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase 9酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。

-20℃保存，Ac-LEHD-pNA需避光保存。

1、须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100µl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。  

           2、Ac-LEHD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装和避光保存。

           3、测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒。

4、有文献报道少数类型的细胞凋亡检测不到Caspase 9的激活。可能存在非依赖于Caspase-9 活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-9 活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

5、本试剂盒的裂解液可以和碧波生产的其它Caspase活性检测试剂盒的裂解液通用，即本试剂盒裂解液制备的蛋白样品可以用于碧波其它Caspase活性检测试剂盒的检测。

6、细胞数量需达到3～5×10⁶个或新鲜组织100mg，以便能达到测定需要的100～200μg蛋白的要求，因为Caspase-9 的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

7、样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。

          8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。