Catalog Number: B58620
Amount: 100T
产品简介:

  葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH检测试剂盒(WST-8法) 是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应,通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6PDH活性的检测试剂盒。 Ø

   葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,简称G6PDH或G6PD)可催化葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate,G6P)转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂(6-phosphogluconate, 6-PG),这是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的第一步,也是该途径的限速步骤。磷酸戊糖途径对于NADPH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,也称为还原型辅酶II)和戊糖的生成至关重要。NADPH对于通过GSH的再生来调控氧化还原平衡以及脂肪酸生物合成来说都至关重要。所以G6PDH的缺乏会导致由于不能生成NADPH而引起的一些疾病,如新生儿黄疸、非免疫性溶血性贫血等。

  检测原理:葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate, 6-PG),在这一反应过程中NADP+ 被还原为NADP,生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan,在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中G6PDH活性呈正比关系。 WST-8法检测G6PDH的原理参考图1。

             

           图1. WST-8法检测G6PDH的原理图 

    本试剂盒适用于检测细胞、组织、血液以及其它适当样品。 

    本试剂盒用于96孔板 按每孔体积100μl 可以测定100个样品。

特点:

  • 本试剂盒WST-8法与WST-1、MTT、XTT等相比,检测灵敏度更高,更易溶解,并且更加稳定。线性范围更宽,灵敏度更高,使用便捷。
  • 本试剂盒使用便捷  使用细胞、组织等的裂解液、体液即可进行检测,无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的G6PDH。
  • 本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽。可以每孔含量低至0.05mU的G6PDH,在1mU/ml (0.05mU/孔)至100mU/ml (5mU/孔) 之间呈现良好的线性关系。
试剂盒组份:

组份

规格(100T)

保存

组份A:分析Buffer

5.5mL

-20℃,避光

组份B: G6PDH底物

220μl

组份C:显色液

220μl

组份D: G6PDH提取液

50mL

组份E: G6PDH (250U/mL)

25μl

操作步骤:

 A:G6PDH标准溶液的制备

  组份D 提取液解冻后置于冰上预冷备用。

  将G6PDH标准品(组份E  250mU/μL)用提取液(组份D)稀释100倍为2.5mU/μL的标准液,  在96孔板每孔加入0, 0.5, 1, 2,5, 10μL的标准液, 并用提取液每孔补至50μL体积, 则成为 0 (空白), 1.25, 2.5, 5,12.5, 25mU/孔的标准溶液。 

B:样品的准备     

  细胞组织样品 取1×106个细胞或10–100 mg红细胞或10–20 mg剪碎的组织样品用PBS洗涤后,加入200–400μl或等体积的预冷提取液(组份D),置冰上吹打或匀浆,以促进裂解释放G6PDH。随后12,000-15,000g,4ºC 离心10分钟,取上清1-50μL作为待测样品,置冰上备用。       

C: 分析反应

   1. 配制G6PDH分析液:

      根据所需检测的背景对照、标准品和样品的数量,按下表配制适量的G6PDH分析液,并注意现配现用。

 

样本空白孔

样本和标准液孔

组份A: 分析Buffer

48μL

46μL

组份C: 显色液

2μL

2μL

组份B: G6PDH底物

-

2μL

 

 2. 样本测定

  •  取一定体积Sv≤50μL(可以预优化)的待测样本加至96孔板的孔中,不足50μL则用提取液补至50μL; 
  • 吸取上述G6PDH分析液,按每孔50μL加至样本和标准溶液各孔中,每孔共100μL,置摇床或用移液器混匀;  
  • 37ºC,避光,反应5-10 min(如果显色淡 可以延长15-30min);

    3. 酶标仪测 450 nm (A450)

D:样品中G6PDH活性的计算

  1. 将0 mU标准溶液作为背景对照。将全部(标准品和样品)的吸光度减去背景对照的吸光度  

  2. 以标准溶液G6PDH浓度为横坐标,减去背景值的吸光度为纵坐标,绘制出标准曲线。

    依据标准曲线 从样品的吸光度 确定样本的活力单位数(Su)。

    则样本G6PDH的活性为 Su/Sv   

    (Su:样本的活力单位数mU,Sv:加入孔里的样本体积, 见C2步)

  

   例:某样本

    Su = 5.84 mU 

    Sv = 50 μL

    其G6PDH的活性 = 5.84mU /50μL= 116.8 U/L 

保存条件:

    -20℃,1年